Sensibilidade da membrana mitocondrial interna para na+ revela piscinas de COQ funcionais parcialmente segmentadas
Summary
Este protocolo descreve um ensaio comparativo, utilizando atividades complexas mitocondriais CI+CIII e CII+CIII na presença ou ausência de Na+, para estudar a existência de piscinas de CoQ funcionais parcialmente segmentadas.
Abstract
As piscinas de ubiquinona (CoQ) na membrana mitocondrial interna (IMM) são parcialmente segmentadas para enzimas complexas I ou dependentes de FAD. Tal subdivisão pode ser facilmente avaliada por um ensaio comparativo usando NADH ou succinato como doadores de elétrons em mitocôndrias descongeladas congeladas, nas quais a redução do citocromo c (cyt c) é medida. O ensaio se baseia no efeito de Na+ no IMM, diminuindo sua fluidez. Aqui, apresentamos um protocolo para medir a atividade naDH-cyt c oxidoreductase e atividades de succinato-cyt c oxidoreductase na presença de NaCl ou KCl. As reações, que dependem da mistura de reagentes em uma cuvette de forma stepwise, são medidas espectrofotometricamente durante 4 minutos na presença de Na+ ou K+. A mesma mistura é realizada em paralelo na presença dos inibidores específicos da enzima, a fim de subtrair a alteração inespecífica na absortância. A atividade nadh-cyt c oxidoreductase não diminui na presença de nenhuma dessas alcaações. No entanto, a atividade de succinato-cyt c oxidoreductase diminui na presença de NaCl. Este simples experimento destaca: 1) o efeito de Na+ na diminuição da fluidez do IMM e da transferência de CoQ; 2) que o supercomplexO I+III2 protege a transferência de ubiquinona (CoQ) de ser afetada pela redução da fluidez do IMM; 3) que a transferência de CoQ entre CI e CIII é funcionalmente diferente da transferência de CoQ entre CII e CIII. Esses fatos sustentam a existência de piscinas de CoQ funcionalmente diferenciadas no IMM e mostram que podem ser reguladas pelo ambiente Na+ em mudança das mitocôndrias.
Introduction
O sistema de fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS) é a principal via que conduz a síntese de triptosfato de adenosina (ATP), a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e o consumo de equivalentes redutores, como nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) ou succinato, por mitocôndrias. O sistema OXPHOS é composto por cinco complexos proteicos: Complexo I (CI) oxida NADH e reduz o CoQ em ubiquinol (CoQH2). O Complexo II (CII) oxida o succinato em fumarate e reduz o CoQ em CoQH2. Complexo III (CIII) oxida CoQH2 de volta ao CoQ, reduzindo citocromo c (cyt c). Finalmente, o complexo IV (CIV) oxida o cit c e reduz o oxigênio à água. Esta cadeia de oxidoredução, a chamada cadeia de transporte de elétrons (mETC), é acoplada ao bombeamento de H+ através do IMM, que cria um gradiente eletroquímico usado pelo complexo V (CV) para fosfortar difosfato de adenosina (ADP) em ATP.
os complexos mETC podem estar sozinhos no IMM ou montar em estruturas quaternárias chamadas supercomplexos. O CIV pode montar com CIII, formando o III2+IV ou Q-respirasome (como é capaz de respirar na presença de CoQH2)1,2,3 ou formando homodimers ou homooligomers4. O CIII pode interagir com a CI, formando o supercomplexo I+III25. Finalmente, a CI também é capaz de interagir com o Q-respirasome, construindo o I+III2+IV ou N-respirasome (pois pode respirar consumindo NADH)1,6,7,8,9,10.
CoQ e cyt c são portadores de elétrons móveis encarregados da transferência de elétrons de CI/CII para CIII, e de CIII para CIV, respectivamente. Se os supercomplexos impõem ou não uma restrição local funcional para essas operadoras tem sido uma questão de intenso debate ao longo das últimas duas décadas 2,7,11,12,13,14,15,16,17. No entanto, vários grupos independentes demonstraram que o CoQ e o cyt c podem ser segmentados funcionalmente em piscinas no IMM. Em relação ao CoQ, ele pode ser segmentado funcionalmente em um pool específico de CoQ para CI (CoQNAD) e outro pool dedicado às enzimas dependentes de FAD (CoQFAD)1,7,12,18,19. No entanto, para diferenciar a existência de piscinas de CoQ funcionais parcialmente segmentadas, foram necessárias a superexpressão da oxidase alternativa (AOX) e a geração de mutantes específicos de MTDNA, que podem montar IC na ausência de CIII, foram necessários 1,19,20.
O mecanismo de produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) durante a hipóxia era desconhecido até recentemente. Após a hipóxia aguda, a IC sofre a transição ativa/deativa (A/D), que envolve a diminuição de sua atividade de oxidoreductase de bombeamento H+ . Tal diminuição no bombeamento H+ acidifica a matriz mitocondrial e dissolve parcialmente os precipitados de cálcio-fosfato na matriz mitocondrial, liberando ca2+solúvel. Esse aumento no Ca2+ solúvel ativa o trocador Na+/Ca2+ (NCLX), que extrude o Ca2+ em troca de Na+. Mitocondrial Na+ o aumento interage com fosfolipídios no lado interno do IMM, diminuindo sua fluidez e transferência de CoQ entre CII e CIII, finalmente produzindo ânion de superóxido, um sinal de redox21. Curiosamente, a transferência de CoQ só foi diminuída entre CII e CIII, mas não entre CI e CIII, destacando que 1) Na+ foi capaz de modular apenas uma das piscinas coq existentes nas mitocôndrias; 2) existem piscinas de CoQ funcionalmente diferenciadas no IMM. Assim, um protocolo amplamente utilizado para o estudo de atividades enzimárias mitocondriais pode ser utilizado para avaliar a existência das piscinas coq mencionadas.
O protocolo atual baseia-se na medição da redução do cit c oxidado, o substrato do CIII, por absorção na presença de succinato (ou seja, substrato CII) ou NADH (ou seja, substrato ci). A mesma amostra é dividida em duas, uma das quais será tratada com LCI, e a outra com a mesma concentração de NaCi. Dessa forma, dado que o Na+ diminui a fluidez do IMM, se o CoQ existisse em um pool único no IMM, tanto CI+CIII quanto CII+CIII diminuiriam na presença de Na+. No entanto, se o CoQ existisse em pools de CoQ funcionais parcialmente segmentados, o efeito de Na+ seria evidente principalmente (ou apenas) sobre a atividade CII+CIII, mas não no CI+CIII. Como publicado recentemente21, Na+ afeta apenas a transferência de CoQ entre CII e CIII (Figura 1C,D), mas não entre CI e CIII (Figura 1A,B).
Este protocolo, juntamente com uma panóplia de técnicas, tem sido utilizado para confirmar a existência de piscinas de CoQ funcionais parcialmente segmentadas no IMM, uma dedicada à CI (ou seja, CoQNAD), e outra dedicada às enzimas ligadas à FAD (ou seja, CoQFAD)1,3,7; observação que, embora continue a ser debatida22, foi corroborada independentemente por vários grupos 7,19. Assim, a supermontagem da CI em supercomplexos impacta na mobilidade local do CoQ, facilitando seu uso pelo CIII dentro do supercomplexo 1,7,13,14,23,24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora este protocolo represente um procedimento muito simples para identificar a existência das piscinas de CoQ parcialmente segmentadas, existem algumas medidas críticas a serem tomadas em conta. Substratos (ou seja, NADH ou succinato) são preferencialmente adicionados por último, uma vez que a autooxidação desses compostos pode ocorrer. A inversão de Cuvette deve ter cuidado para evitar a formação de bolhas que possam interferir na leitura.
Além disso, a presente técnica apresent…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr. C. Jimenez e E. R. Martínez-Jimenez pela assistência técnica. Este estudo foi apoiado pelo MICIN: RTI2018-099357-B-I00 e HFSP (RGP0016/2018). O CNIC conta com o apoio do Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), do Ministério da Ciencia, da Innovación e das Universidades (MCNU) e da Fundação Pró CNIC e do Centro de Excelência Severo Ochoa (SEV-2015-0505). Figura 2 criada com BioRender.com.
Materials
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
Riferimenti
- Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
- Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish. EMBO Reports. 21 (7), 50287 (2020).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
- Jeon, T. J., et al. A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex. Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).
- Gu, J., et al. The architecture of the mammalian respirasome. Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. The architecture of respiratory supercomplexes. Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).
- Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome. Elife. 5, 21290 (2016).
- Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses. EMBO Reports. 20 (10), 47865 (2019).
- Berndtsson, J., et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Reports. 21 (12), 51015 (2020).
- Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).
- Enriquez, J. A. Supramolecular organization of respiratory complexes. Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).
- Genova, M. L., Lenaz, G. A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria. Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).
- Letts, J. A., Sazanov, L. A. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).
- Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. The enigma of the respiratory chain supercomplex. Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).
- Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118 (2021).
- Szibor, M., et al. Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137 (2020).
- Guaras, A., et al. The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency. Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).
- Hernansanz-Agustin, P., et al. Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain. Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).
- Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).
- Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
- Enriquez, J. A., Lenaz, G. Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes. Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).
- Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly. Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).
- Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).
- den Brave, F., Becker, T. Supercomplex formation boosts respiration. EMBO Reports. 21 (12), 51830 (2020).
- Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).
- Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
- Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. Effect of sodium chloride on a lipid bilayer. Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).
- Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).
