Microscopía electrónica de transmisión in situ inducida por luz para la observación de la interacción líquido-materia blanda

Summary

El presente protocolo describe modificaciones del microscopio electrónico de transmisión (TEM) con un sistema de iluminación de luz, la fabricación de células líquidas y observaciones TEM in situ de interacciones inducidas por la luz entre células bacterianas y un fotosensibilizador. También se discuten los métodos de preparación de muestras, el daño del haz de electrones y las imágenes.

Abstract

El protocolo actual describe las modificaciones de la configuración del microscopio electrónico de transmisión (TEM) para observaciones in situ inducidas por la luz. Una fibra óptica de vidrio insertada en la columna de electrones sobre el poste de la lente del objetivo, y un láser, una fuente de luz ajustable, se utilizó para fabricar el dispositivo. Después de que el iluminador ha sido calibrado utilizando un sistema de medición externo, permite ajustar la intensidad de la iluminación a las necesidades del proceso observado. Este sistema de iluminación se utilizó para obtener imágenes de fenómenos de terapia fotodinámica antimicrobiana, que actualmente son objeto de una intensa investigación. La muestra se preparó detectando una suspensión de bacterias en un sustrato de carbono, grafeno o nitruro de silicio, borrando el exceso de solución, detectando la solución fotosensibilizadora, secando el exceso de líquido nuevamente y luego ensamblando la celda líquida con un segundo sustrato o película de grafeno. El proceso del experimento de imágenes en sí incluye elegir el lugar correcto para la observación con el uso de un aumento bajo y una dosis mínima de electrones, y luego la activación cíclica de la fuente de luz para capturar imágenes posteriores a intervalos específicos con la cantidad mínima de electrones necesarios. La dosis de electrones de cada exposición y el tiempo y la intensidad de la iluminación utilizada deben registrarse cuidadosamente debido a la complejidad de los fenómenos observados, ya que, al mismo tiempo, el proceso es impulsado tanto por la luz como por los electrones. Después de realizar el experimento real, se deben realizar observaciones de control adicionales, en las que se usan las mismas dosis de electrones pero sin influencia de luz adicional y se usan dosis más pequeñas de electrones para dosis más altas de luz. Esto permite distinguir los efectos microestructurales inducidos por la luz de los causados por los electrones tanto en el campo de la vida como en el de la ciencia de los materiales.

Introduction

Los fenómenos inducidos por la luz en alta resolución son interesantes en muchos campos como la nanoingeniería 1,2,3, la catálisis ^4,5 y la biofotónica⁶. Algunos diseños originales que permiten tales experimentos se pueden encontrar en la literatura, incluyendo modificaciones de los portamuestras 1,4,7,8,9 y la fibra óptica unida al microscopio ^10,11.

La combinación de iluminación de luz, un ambiente líquido y microscopía electrónica de transmisión (TEM) brinda una gran oportunidad para estudios detallados y dinámicos de procesos fotoinducidos. Sin embargo, la condición de alto vacío dentro del microscopio es bastante desfavorable para muchos líquidos, especialmente soluciones de agua. La encapsulación líquida, que lo protege del medio ambiente, se puede lograr utilizando algunas técnicas basadas principalmente en sustratos de grafeno 12, nitruro de silicio¹³ o carbono¹⁴. Además de la investigación en ciencia de materiales², las llamadas células líquidas ofrecen posibilidades para realizar observaciones microscópicas no convencionales en especímenes biológicos cerca de sus condiciones nativas¹⁵. Tales observaciones son extremadamente exigentes, especialmente para microorganismos vivos como las células bacterianas. El haz de electrones como radiación ionizante causa daños irreversibles a las muestras hidratadas, por lo que la dosis de electrones debe especificarse¹⁶. Esto es necesario para minimizar los efectos desfavorables, controlar el daño y evitar artefactos confusos. La dosis máxima óptima de electrones que permite observaciones de células vivas sigue siendo un tema cuestionable¹⁶, pero la dosis de 30 e⁻/nm² parece ser el valor umbral, al menos para las bacterias¹⁷.

Algunos de los temas de interés para tales estudios microscópicos son los procesos durante la terapia fotodinámica antimicrobiana (APDT)¹⁸. En resumen, la terapia procede de la siguiente manera. Las células bacterianas están rodeadas por el líquido fotosensible llamado fotosensibilizador. Cuando la iluminación de la luz se da a una longitud de onda específica, las especies reactivas citotóxicas de oxígeno (ROS) se generan a partir de la transferencia de energía o carga de las moléculas fotosensibilizadoras excitadas al oxígeno naturalmente presente en la solución. Los patógenos expuestos a ROS se inactivan rápidamente con una eficiencia muy alta, sin efectos secundarios¹⁹. La respuesta a la terapia varía para distintos microbios; por ejemplo, el impacto del mismo fotosensibilizador puede ser bastante diferente para las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas²⁰. En general, se ha establecido que el objetivo principal de ROS son las estructuras externas de las células, donde el daño resulta en trastornos funcionales de la membrana celular y, en consecuencia, conducen a la muerte de las bacterias^21,22. Sin embargo, el daño a los ácidos nucleicos y proteínas también puede considerarse una causa de inactivación¹⁸, por lo que aún se desconoce qué estructuras celulares son los principales objetivos durante este proceso¹⁹. Una comprensión más profunda de los procesos dañinos podría ayudar a mejorar esta terapia definitiva. En comparación con los métodos de microscopía óptica utilizados en la investigación de APDT²³, las técnicas TEM ofrecen más posibilidades de observar el mecanismo APDT con mayor resolución y aumento²⁴. TEM ya se ha utilizado con éxito para la observación celular durante la terapia en curso, lo que nos permitió estudiar el daño bacteriano grampositivo y describir los cambios que ocurren dentro de la pared celular en detalle ^6,25.

El protocolo actual presenta una configuración experimental adecuada para imágenes de alta resolución de la inactivación de bacterias inducida por la luz utilizando TEM, que requiere un sistema de iluminación de luz adecuado, la encapsulación de células con un líquido y un estricto control de la dosis de electrones. La bacteria utilizada para la observación fue Staphylococcus aureus, y se utilizó una solución de azul de metileno como fotosensibilizador. La configuración especial de iluminación de luz comprende un láser semiconductor sintonizable conectado directamente a la columna del microscopio utilizando la fibra de luz. Este diseño proporciona una irradiación uniforme en toda la muestra debido a la colocación casi paralela de la fibra óptica en el eje del microscopio. La luz monocromática de alta intensidad generada por el láser se puede utilizar para estudiar diversos efectos fotoquímicos. La luz utilizada en el experimento tenía una longitud de onda igual a 660 nm porque, en la región visible, el azul de metileno tiene picos de absorción a 613 nm y 664 nm²⁶. El protocolo para la encapsulación líquida se basa en sustratos de carbono, lo que hace que el procedimiento sea rápido y sin complicaciones. Finalmente, se presenta un método para la observación de TEM in situ de baja dosis de células en líquido. Se discuten las dificultades con respecto a la preparación de la muestra, los efectos de la dosis de electrones en la muestra sensible y la interpretación razonable de la imagen.

Protocol

1. Modificación del microscopio electrónico de transmisión Modifique el microscopio electrónico de transmisión conectando la fibra óptica (consulte la Tabla de materiales) a la columna del microscopio en la parte superior de la lente del objetivo. Permita unos pocos centímetros de espacio entre la lente del objetivo y la lente del condensador, además de una ranura libre para accesorios.NOTA: También se puede emplear un portamuestras dedicado4</sup…

Representative Results

La configuración experimental fue diseñada para observar los procesos inducidos por la luz que ocurren en un líquido con alta resolución. El análisis competitivo de las imágenes nos permitió distinguir el daño causado por el haz de electrones de los cambios relacionados con la reacción fotoquímica. El efecto del haz de electrones en la muestra sensible (en este caso, las células encapsuladas con líquido) fue visible en toda el área irradiada a medida que los electrones penetraban a través de ella uniformeme…

Discussion

La instalación y puesta en marcha del iluminador requieren conocimientos básicos de servicio y pueden dañar el microscopio. La forma más sencilla de introducir la luz en el microscopio es conectar la fibra óptica desde la parte superior de la lente del objetivo, donde generalmente hay espacio para las bobinas de deflexión TEM y detectores adicionales. También se puede esperar más espacio libre de los dispositivos de entrada superior más antiguos, donde la misma ubicación alberga el bloqueo de vacío de muestra …

Materials

Carbon film on 200 mesh copper grid	Agar Scientific	AGS160	The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation
Crossover Tweezers	Dumont	N5	The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation
Photodiode Power Sensor	ThorLabs	S130C	The sensor used for light intensity measurement
Polyimide-Coated Multimode Fiber	Thorlabs	FG400UEP	Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388
Transmission Electron Microscope	Hitachi	H-800	Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification
Tuneable Diode Laser	CNI	MRL-III-660D	The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum