Ljusinducerad in situ-transmissionselektronmikroskopi för observation av interaktionen mellan vätska och mjuk materia

Summary

Detta protokoll beskriver transmissionselektronmikroskop (TEM) modifieringar med ett ljusbelysningssystem, tillverkning av flytande celler och in situ TEM-observationer av ljusinducerade interaktioner mellan bakterieceller och en fotosensibiliserare. Provberedningsmetoderna, elektronstråleskador och avbildning diskuteras också.

Abstract

Det nuvarande protokollet beskriver modifieringarna av transmissionselektronmikroskopet (TEM) för in situ ljusinducerade observationer. En optisk glasfiber införd i elektronkolonnen ovanför objektivlinspolstycket och en laser, en justerbar ljuskälla, användes för att tillverka enheten. Efter att belysningen har kalibrerats med hjälp av ett externt mätsystem tillåter det en att justera belysningens intensitet till behoven hos den observerade processen. Detta belysningssystem användes för att avbilda antimikrobiella fotodynamiska terapifenomen, som för närvarande är föremål för intensiv forskning. Provet framställdes genom att upptäcka en suspension av bakterier på ett kol-, grafen- eller kiselnitridsubstrat, blotta överskottslösningen, upptäcka fotosensibiliseringslösningen, blotta överskottsvätskan igen och sedan montera vätskecellen med ett andra substrat eller grafenfilm. Processen med själva avbildningsexperimentet innefattar att välja rätt plats för observation med användning av låg förstoring och en minsta dos elektroner och sedan cyklisk aktivering av ljuskällan för att fånga efterföljande bilder med angivna intervall med den minsta mängd elektroner som behövs. Elektrondosen för varje exponering och tiden och intensiteten för belysning som används måste registreras noggrant på grund av komplexiteten hos de observerade fenomenen eftersom processen samtidigt är både ljus- och elektrondriven. Efter att själva experimentet har utförts måste ytterligare kontrollobservationer göras, där samma doser elektroner används men utan ytterligare ljuspåverkan och mindre doser elektroner används för högre doser ljus. Detta gör det möjligt att skilja ljusinducerade mikrostrukturella effekter från de som orsakas av elektroner inom både livs- och materialvetenskap.

Introduction

Ljusinducerade fenomen i hög upplösning är intressanta inom många områden som nanoengineering 1,2,3, katalys ^4,5 och biofotonik⁶. Några ursprungliga mönster som tillåter sådana experiment finns i litteraturen, inklusive modifieringar av provhållarna 1,4,7,8,9 och den optiska fibern fäst vid mikroskopet ^10,11.

Kombinationen av ljusbelysning, en flytande miljö och transmissionselektronmikroskopi (TEM) ger en stor möjlighet till detaljerade, dynamiska studier av fotoinducerade processer. Högvakuumtillståndet inuti mikroskopet är emellertid ganska ogynnsamt för många vätskor, särskilt vattenlösningar. Vätskeinkapsling, som skyddar den från miljön, kan uppnås med hjälp av några tekniker baserade huvudsakligen på grafen¹², kiselnitrid¹³ eller^{kol 14} substrat. Förutom forskning inom materialvetenskap² erbjuder så kallade flytande celler möjligheter att genomföra okonventionella mikroskopiska observationer på biologiska prover nära deras ursprungliga förhållanden¹⁵. Sådana observationer är extremt krävande, särskilt för levande mikroorganismer som bakterieceller. Elektronstrålen som joniserande strålning orsakar irreversibel skada på de hydratiserade proverna, så elektrondosen måste specificeras¹⁶. Detta är nödvändigt för att minimera ogynnsamma effekter, kontrollera skadorna och undvika förvirrande artefakter. Den optimala maximala elektrondosen som tillåter observationer av levande celler är fortfarande ett tveksamt ämne¹⁶, men dosen på 30 e⁻/nm² verkar vara tröskelvärdet, åtminstone för bakterier¹⁷.

Några av de ämnen som är av intresse för sådana mikroskopiska studier är processer under antimikrobiell fotodynamisk terapi (APDT)¹⁸. Kort sagt, terapin fortsätter enligt följande. Bakteriecellerna är omgivna av den ljuskänsliga vätskan som kallas fotosensibiliserare. När ljusbelysning ges vid en specifik våglängd genereras de cytotoxiska reaktiva syrearterna (ROS) från energi- eller laddningsöverföring från de exciterade fotosensibiliserande molekylerna till syret som finns naturligt i lösningen. Patogener som utsätts för ROS inaktiveras snabbt med mycket hög effektivitet, utan biverkningar¹⁹. Svaret på terapin varierar för distinkta mikrober – till exempel kan effekten av samma fotosensibiliserare vara helt annorlunda för grampositiva och gramnegativa bakterier²⁰. I allmänhet har det fastställts att huvudmålet för ROS är cellernas yttre strukturer, där skador resulterar i funktionella störningar i cellmembranet och följaktligen leder till bakteriedöd^21,22. Skador på nukleinsyror och proteinerkan emellertid också betraktas som en orsak till inaktivering¹⁸, så det är fortfarande okänt vilka cellstrukturer som är huvudmålen under denna process¹⁹. En djupare förståelse för de skadliga processerna kan bidra till att förbättra denna definitiva terapi. Jämfört med de ljusmikroskopimetoder som används i APDT-forskning²³ ger TEM-tekniker fler möjligheter att titta på APDT-mekanismen med högre upplösning och förstoring²⁴. TEM har redan framgångsrikt använts för cellobservation under pågående behandling, vilket gjorde det möjligt för oss att studera grampositiva bakterieskador och beskriva de förändringar som sker i cellväggen i detalj ^6,25.

Det nuvarande protokollet presenterar en lämplig experimentell inställning för högupplöst avbildning av ljusinducerad bakterieinaktivering med TEM, vilket kräver ett ordentligt ljusbelysningssystem, inkapsling av celler med en vätska och strikt elektrondoskontroll. Bakterierna som användes för observationen var Staphylococcus aureus, och en metylenblå lösning användes som fotosensibiliserare. Den speciella ljusbelysningsinställningen består av en avstämbar halvledarlaser ansluten direkt till mikroskopkolonnen med hjälp av ljusfibern. Denna design ger enhetlig bestrålning genom hela provet på grund av den nästan parallella placeringen av den optiska fibern till mikroskopaxeln. Monokromatiskt ljus med hög intensitet som genereras av lasern kan sedan användas för att studera olika fotokemiska effekter. Ljuset som användes i experimentet hade en våglängd lika med 660 nm eftersom metylenblått i det synliga området har absorptionstoppar vid 613 nm och 664 nm²⁶. Protokollet för vätskeinkapsling är baserat på kolsubstrat, vilket gör proceduren snabb och okomplicerad. Slutligen presenteras en metod för lågdos in situ TEM-observation av celler i vätska. Svårigheterna med provberedning, elektrondoseffekter på det känsliga provet och rimlig bildtolkning diskuteras.

Protocol

1. Modifiering av transmissionselektronmikroskop Ändra överföringselektronmikroskopet genom att ansluta den optiska fibern (se materialtabell) till mikroskopkolonnen högst upp på objektivlinsen. Tillåt några centimeter utrymme mellan objektivlinsen och kondensorlinsen, plus en gratis plats för tillbehör.OBS: En dedikerad provhållare4 eller en hållare för katodoluminescerande observationer i omvänd konfiguration1 k…

Representative Results

Den experimentella installationen var utformad för att observera de ljusinducerade processerna som förekommer i en vätska med hög upplösning. Konkurrensanalysen av bilderna gjorde det möjligt för oss att skilja skadorna orsakade av elektronstrålen från förändringar relaterade till den fotokemiska reaktionen. Effekten av elektronstrålen på det känsliga provet (i detta fall cellerna inkapslade med vätska) var synliga över hela det bestrålade området när elektronerna trängde igenom det likformigt. Naturl…

Discussion

Installation och idrifttagning av belysningen kräver grundläggande servicekunskap och kan skada mikroskopet. Det enklaste sättet att introducera ljuset till mikroskopet är att ansluta den optiska fibern från toppen av objektivlinsen, där det vanligtvis finns plats för TEM-avböjningsspolar och ytterligare detektorer. Mer ledigt utrymme kan också förväntas från äldre toppinmatningsenheter, där samma plats rymmer provvakuumlåset och provinstallationsmekanismen. Denna konfiguration beskrivs allmänt i en tidig…

Materials

Carbon film on 200 mesh copper grid	Agar Scientific	AGS160	The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation
Crossover Tweezers	Dumont	N5	The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation
Photodiode Power Sensor	ThorLabs	S130C	The sensor used for light intensity measurement
Polyimide-Coated Multimode Fiber	Thorlabs	FG400UEP	Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388
Transmission Electron Microscope	Hitachi	H-800	Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification
Tuneable Diode Laser	CNI	MRL-III-660D	The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum