Microscopia elettronica a trasmissione in situ indotta dalla luce per l'osservazione dell'interazione liquido-materia molle

Summary

Il presente protocollo descrive le modifiche al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) con un sistema di illuminazione della luce, la fabbricazione di cellule liquide e osservazioni TEM in situ delle interazioni indotte dalla luce tra cellule batteriche e un fotosensibilizzatore. Vengono inoltre discussi i metodi di preparazione del campione, il danno al fascio di elettroni e l’imaging.

Abstract

L’attuale protocollo descrive le modifiche della configurazione del microscopio elettronico a trasmissione (TEM) per le osservazioni indotte dalla luce in situ . Una fibra ottica di vetro inserita nella colonna di elettroni sopra il polo dell’obiettivo e un laser, una sorgente luminosa regolabile, sono stati utilizzati per fabbricare il dispositivo. Dopo che l’illuminatore è stato calibrato utilizzando un sistema di misurazione esterno, consente di regolare l’intensità dell’illuminazione alle esigenze del processo osservato. Questo sistema di illuminazione è stato utilizzato per visualizzare fenomeni di terapia fotodinamica antimicrobica, attualmente oggetto di intense ricerche. Il campione è stato preparato individuando una sospensione di batteri su un substrato di carbonio, grafene o nitruro di silicio, tamponando la soluzione in eccesso, individuando la soluzione fotosensibilizzante, tamponando nuovamente il liquido in eccesso e quindi assemblando la cella liquida con un secondo substrato o film di grafene. Il processo dell’esperimento di imaging stesso include la scelta del posto giusto per l’osservazione con l’uso di un basso ingrandimento e una dose minima di elettroni, e quindi l’attivazione ciclica della sorgente luminosa per catturare immagini successive a intervalli specificati con la minima quantità di elettroni necessari. La dose elettronica di ciascuna esposizione e il tempo e l’intensità dell’illuminazione utilizzati devono essere accuratamente registrati a causa della complessità dei fenomeni osservati poiché, allo stesso tempo, il processo è guidato sia dalla luce che dall’elettrone. Dopo aver eseguito l’esperimento effettivo, devono essere fatte ulteriori osservazioni di controllo, in cui vengono utilizzate le stesse dosi di elettroni ma senza ulteriore influenza della luce e dosi più piccole di elettroni vengono utilizzate per dosi più elevate di luce. Ciò consente di distinguere gli effetti microstrutturali indotti dalla luce da quelli causati dagli elettroni sia nel campo della vita che nella scienza dei materiali.

Introduction

I fenomeni indotti dalla luce in alta risoluzione sono interessanti in molti campi come la nanoingegneria 1,2,3, la catalisi ^4,5 e la biofotonica ⁶. Alcuni disegni originali che consentono tali esperimenti possono essere trovati in letteratura, comprese le modifiche dei supporti del campione 1,4,7,8,9 e la fibra ottica attaccata al microscopio ^10,11.

La combinazione di illuminazione luminosa, ambiente liquido e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) offre una grande opportunità per studi dettagliati e dinamici dei processi fotoindotti. Tuttavia, la condizione di alto vuoto all’interno del microscopio è piuttosto sfavorevole per molti liquidi, in particolare le soluzioni acquose. L’incapsulamento liquido, che lo protegge dall’ambiente, può essere ottenuto utilizzando alcune tecniche basate principalmente su substrati di grafene 12, nitruro di silicio¹³ o carbonio¹⁴. Oltre alla ricerca nella scienza dei materiali², le cosiddette cellule liquide offrono la possibilità di condurre osservazioni microscopiche non convenzionali su campioni biologici vicini alle loro condizioni native¹⁵. Tali osservazioni sono estremamente impegnative, specialmente per i microrganismi viventi come le cellule batteriche. Il fascio di elettroni come radiazione ionizzante provoca danni irreversibili ai campioni idratati, quindi la dose di elettroni deve essere specificata¹⁶. Ciò è necessario per ridurre al minimo gli effetti sfavorevoli, controllare il danno ed evitare artefatti confusi. La dose massima ottimale di elettroni che consente l’osservazione delle cellule viventi è ancora un argomento discutibile¹⁶, ma la dose di 30 e⁻/nm² sembra essere il valore soglia, almeno per i batteri¹⁷.

Alcuni dei soggetti di interesse per tali studi microscopici sono i processi durante la terapia fotodinamica antimicrobica (APDT)¹⁸. In breve, la terapia procede come segue. Le cellule batteriche sono circondate dal liquido fotosensibile chiamato fotosensibilizzatore. Quando l’illuminazione della luce viene fornita a una lunghezza d’onda specifica, le specie citotossiche reattive dell’ossigeno (ROS) vengono generate dal trasferimento di energia o carica dalle molecole fotosensibilizzatrici eccitate all’ossigeno naturalmente presente nella soluzione. Gli agenti patogeni esposti ai ROS vengono rapidamente inattivati con un’efficienza molto elevata, senza effetti collaterali¹⁹. La risposta alla terapia varia per microbi distinti – ad esempio, l’impatto dello stesso fotosensibilizzatore può essere molto diverso per i batteri Gram-positivi e Gram-negativi²⁰. In generale, è stato stabilito che il bersaglio principale dei ROS sono le strutture esterne delle cellule, dove il danno provoca disturbi funzionali della membrana cellulare e, di conseguenza, porta alla morte dei batteri^21,22. Tuttavia, anche il danno agli acidi nucleici e alle proteine può essere considerato una causa di inattivazione¹⁸, quindi non è ancora noto quali strutture cellulari siano i principali bersagli durante questo processo¹⁹. Una comprensione più profonda dei processi dannosi potrebbe aiutare a migliorare questa terapia definitiva. Rispetto ai metodi di microscopia ottica utilizzati nella ricerca APDT²³, le tecniche TEM offrono maggiori possibilità di osservare il meccanismo APDT con risoluzione e ingrandimento più elevati²⁴. TEM è già stato utilizzato con successo per l’osservazione cellulare durante la terapia in corso, che ci ha permesso di studiare il danno batterico Gram-positivo e descrivere i cambiamenti che si verificano all’interno della parete cellulare in dettaglio ^6,25.

L’attuale protocollo presenta una configurazione sperimentale adatta per l’imaging ad alta risoluzione dell’inattivazione batterica indotta dalla luce utilizzando TEM, che richiede un adeguato sistema di illuminazione della luce, l’incapsulamento delle cellule con un liquido e un rigoroso controllo della dose di elettroni. Il batterio utilizzato per l’osservazione era Staphylococcus aureus e una soluzione di blu di metilene è stata utilizzata come fotosensibilizzante. La speciale configurazione di illuminazione della luce comprende un laser a semiconduttore sintonizzabile collegato direttamente alla colonna del microscopio utilizzando la fibra luminosa. Questo design fornisce un’irradiazione uniforme in tutto il campione a causa del posizionamento quasi parallelo della fibra ottica all’asse del microscopio. La luce monocromatica di alta intensità generata dal laser può quindi essere utilizzata per studiare vari effetti fotochimici. La luce utilizzata nell’esperimento aveva una lunghezza d’onda pari a 660 nm perché, nella regione visibile, il blu di metilene ha picchi di assorbimento a 613 nm e 664 nm²⁶. Il protocollo per l’incapsulamento liquido si basa su substrati di carbonio, il che rende la procedura rapida e senza complicazioni. Infine, viene presentato un metodo per l’osservazione TEM in situ a basse dosi di cellule in liquido. Vengono discusse le difficoltà relative alla preparazione del campione, agli effetti della dose di elettroni sul campione sensibile e alla ragionevole interpretazione delle immagini.

Protocol

1. Modifica del microscopio elettronico a trasmissione Modificare il microscopio elettronico a trasmissione collegando la fibra ottica (vedere Tabella dei materiali) alla colonna del microscopio nella parte superiore della lente dell’obiettivo. Lasciare alcuni centimetri di spazio tra la lente dell’obiettivo e la lente del condensatore, oltre a una fessura libera per gli accessori.NOTA: È possibile utilizzare anche un portacampioni dedicato4 o un su…

Representative Results

La configurazione sperimentale è stata progettata per osservare i processi indotti dalla luce che si verificano in un liquido ad alta risoluzione. L’analisi competitiva delle immagini ha permesso di distinguere i danni causati dal fascio di elettroni dai cambiamenti legati alla reazione fotochimica. L’effetto del fascio di elettroni sul campione sensibile (in questo caso, le cellule incapsulate con liquido) era visibile in tutta l’area irradiata mentre gli elettroni penetravano uniformemente attraverso di essa. Naturalm…

Discussion

L’installazione e la messa in servizio dell’illuminatore richiedono conoscenze di base e possono danneggiare il microscopio. Il modo più semplice per introdurre la luce al microscopio è collegare la fibra ottica dalla parte superiore della lente dell’obiettivo, dove di solito c’è spazio per le bobine di deflessione TEM e rilevatori aggiuntivi. Ci si può aspettare più spazio libero anche dai vecchi dispositivi top-entry, dove la stessa posizione ospita il blocco a vuoto del campione e il meccanismo di installazione d…

Materials

Carbon film on 200 mesh copper grid	Agar Scientific	AGS160	The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation
Crossover Tweezers	Dumont	N5	The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation
Photodiode Power Sensor	ThorLabs	S130C	The sensor used for light intensity measurement
Polyimide-Coated Multimode Fiber	Thorlabs	FG400UEP	Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388
Transmission Electron Microscope	Hitachi	H-800	Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification
Tuneable Diode Laser	CNI	MRL-III-660D	The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum