Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

إنشاء الطعوم الخارجية المشتقة من مريض الزرد من سرطان البنكرياس لاختبار الحساسية الكيميائية

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/63744
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Biology, University of Pisa, 2General Surgery Unit, Department of Translational Research and New Technologies in Medicine and Surgery, University of Pisa

Summary

تهدف النماذج قبل السريرية إلى تعزيز المعرفة ببيولوجيا السرطان والتنبؤ بفعالية العلاج. تصف هذه الورقة جيل الطعوم الخارجية المشتقة من المرضى (zPDXs) القائمة على الزرد مع شظايا أنسجة الورم. تم علاج zPDXs بالعلاج الكيميائي ، وتم تقييم التأثير العلاجي من حيث موت الخلايا المبرمج للأنسجة المزروعة.

Abstract

السرطان هو أحد الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم ، ويستمر معدل الإصابة بالعديد من أنواع السرطان في الزيادة. وقد أحرز تقدم كبير فيما يتعلق بالفحص والوقاية والعلاج. ومع ذلك ، لا تزال النماذج قبل السريرية التي تتنبأ بملف الحساسية الكيميائية لمرضى السرطان غير موجودة. لسد هذه الفجوة ، تم تطوير نموذج xenograft المشتق من المريض في الجسم الحي والتحقق من صحته. استند النموذج إلى أجنة الزرد (Danio rerio) في 2 أيام بعد الإخصاب ، والتي تم استخدامها كمتلقين لشظايا xenograft من أنسجة الورم المأخوذة من عينة جراحية للمريض.

ومن الجدير بالذكر أيضا أن العينات ثنائية البصر لم يتم هضمها أو تفكيكها ، من أجل الحفاظ على البيئة المكروية للورم ، وهو أمر بالغ الأهمية من حيث تحليل سلوك الورم والاستجابة للعلاج. يفصل البروتوكول طريقة لإنشاء الطعوم الخارجية المشتقة من المريض (zPDXs) من الاستئصال الجراحي للورم الصلب الأولي. بعد الفحص من قبل أخصائي علم التشريح ، يتم تشريح العينة باستخدام شفرة مشرط. تتم إزالة الأنسجة الميتة أو الأوعية أو الأنسجة الدهنية ثم تقطيعها إلى قطع 0.3 مم × 0.3 مم × 0.3 مم.

ثم يتم وضع علامات على القطع الفلورية وزرعها في الفضاء المحيط بأجنة الزرد. يمكن معالجة عدد كبير من الأجنة بتكلفة منخفضة ، مما يتيح إجراء تحليلات عالية الإنتاجية في الجسم الحي للحساسية الكيميائية ل zPDXs للعديد من الأدوية المضادة للسرطان. يتم الحصول على الصور متحدة البؤر بشكل روتيني للكشف عن مستويات موت الخلايا المبرمج التي يسببها العلاج الكيميائي وتحديدها كميا مقارنة بالمجموعة الضابطة. يتمتع إجراء xenograft بميزة زمنية كبيرة ، حيث يمكن إكماله في يوم واحد ، مما يوفر نافذة زمنية معقولة لإجراء فحص علاجي للتجارب السريرية المشتركة.

Introduction

تتمثل إحدى مشاكل أبحاث السرطان السريرية في أن السرطان ليس مرضا واحدا ، ولكنه مجموعة متنوعة من الأمراض المختلفة التي يمكن أن تتطور بمرور الوقت ، مما يتطلب علاجات محددة اعتمادا على خصائص الورم نفسه والمريض1. وبالتالي ، فإن التحدي هو التحرك نحو أبحاث السرطان الموجهة نحو المريض ، من أجل تحديد استراتيجيات شخصية جديدة للتنبؤ المبكر بنتائج علاج السرطان2. هذا مهم بشكل خاص للسرطان الغدي القنوي البنكرياسي (PDAC) ، لأنه يعتبر سرطانا يصعب علاجه ، بمعدل بقاء لمدة 5 سنوات يبلغ 11٪ 3.

لا يزال التشخيص المتأخر والتقدم السريع ونقص العلاجات الفعالة هي المشاكل السريرية الأكثر إلحاحا ل PDAC. لذلك ، يتمثل التحدي الرئيسي في نمذجة المريض وتحديد المؤشرات الحيوية التي يمكن تطبيقها في العيادة لاختيار العلاج الأكثر فعالية بما يتماشى مع الطب الشخصي4،5،6. بمرور الوقت ، تم اقتراح مناهج جديدة لنمذجة أمراض السرطان: نشأت الكائنات العضوية المشتقة من المريض (PDOs) والطعوم الخارجية المشتقة من مريض الفئران (mPDXs) من مصدر لأنسجة الورم البشري. لقد تم استخدامها لإعادة إنتاج المرض لدراسة الاستجابة ومقاومة العلاج ، وكذلك تكرار المرض7،8،9.

وبالمثل ، زاد الاهتمام بنماذج xenograft المشتقة من المرضى (zPDX) القائمة على الزرد ، وذلك بفضل خصائصها الفريدة والواعدة10 ، والتي تمثل أداة سريعة ومنخفضة التكلفة لأبحاث السرطان11,12. تتطلب نماذج zPDX حجم عينة ورم صغير فقط ، مما يجعل الفحص عالي الإنتاجية للعلاج الكيميائي ممكنا13. تعتمد التقنية الأكثر شيوعا المستخدمة في نماذج zPDX على هضم العينة الكاملة وزرع مجموعات الخلايا الأولية ، والتي تعيد إنتاج الورم جزئيا ، ولكن لها عيوب نقص البيئة المكروية للورم والحديث المتبادل بين الخلايا الخبيثة والسليمة14.

يوضح هذا العمل كيف يمكن استخدام zPDXs كنموذج قبل السريري لتحديد ملف تعريف الحساسية الكيميائية لمرضى سرطان البنكرياس. تسهل الاستراتيجية القيمة عملية الكسب غير المشروع ، حيث لا توجد حاجة لتوسيع الخلايا ، مما يسمح بتسريع فحص العلاج الكيميائي. تكمن قوة النموذج في الحفاظ على جميع مكونات البيئة المكروية كما هي في أنسجة سرطان المريض ، لأنه ، كما هو معروف ، يعتمد سلوك الورم على تفاعلها15,16. هذا مناسب للغاية على الطرق البديلة في الأدبيات ، حيث أنه من الممكن الحفاظ على عدم تجانس الورم والمساهمة في تحسين القدرة على التنبؤ بنتائج العلاج والانتكاس بطريقة خاصة بالمريض ، وبالتالي تمكين استخدام نموذج zPDX في التجارب السريرية المشتركة. تصف هذه المخطوطة الخطوات المتبعة في صنع نموذج zPDX ، بدءا من قطعة من استئصال ورم المريض ومعالجته لتحليل الاستجابة للعلاج الكيميائي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وافقت وزارة الصحة العامة الإيطالية على جميع التجارب على الحيوانات الموصوفة ، وفقا للتوجيه 2010/63 / EU بشأن استخدام الحيوانات ورعايتها. وافقت اللجنة الأخلاقية المحلية على الدراسة ، تحت رقم التسجيل 70213. تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع الأشخاص المعنيين. قبل البدء ، يجب إعداد جميع الحلول والمعدات (القسم 1) ويجب عبور الأسماك (القسم 2).

1. إعداد الحلول والمعدات

ملاحظة: انظر الجدول 1 للاطلاع على الحلول والوسائط التي يتعين إعدادها.

  1. دعم هلام الأغاروز
    1. قم بوزن مسحوق الأغاروز في قارورة قابلة للميكروويف وقم بإذابته في حجم معين من وسط الزرد E3 لصنع هلام 1٪. يسخن في الميكروويف حتى يذوب الأغاروز تماما.
      ملاحظة: لا تفرط في غلي المحلول.
    2. صب الأغاروز المذاب في طبق بتري وانتظر حتى يصلب الجل تماما.
    3. اصنع أسطوانات أغاروز صغيرة (~ 5 مم) باستخدام ماصة باستور بلاستيكية مع قطع طرفها. بمجرد تحضيرها ، يخزن في طبق بتري على حرارة 4 درجات مئوية ملفوفة بورق الألمنيوم.
  2. الإبر الزجاجية الدقيقة
    1. اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات باستخدام مجتذب للحصول على إبر دقيقة (الإعدادات: HEAT 990 ، PULL 550).
      ملاحظة: من شعيرات دموية واحدة ، من الممكن الحصول على إبرتين دقيقتين بقطر طرف 10 ميكرومتر.

2. عبور الأسماك وجمع البيض

  1. نقل الأسماك البالغة في أحواض التكاثر قبل 3 أيام من زرع الأنسجة ، كما هو موضح من قبل Avdesh et al.17.
  2. ملاحظة: يوصى بنسبة 1: 1 أو 2: 3 من الذكور إلى الإناث. يجب أن تكون كثافة الأسماك بحد أقصى خمسة أسماك لكل لتر من الماء. أبق الذكور والإناث منفصلين بحاجز طوال الليل.
  3. في اليوم التالي ، قم بإزالة الحاجز والسماح للأسماك بالتزاوج.
  4. أخرج الأسماك من أحواض التكاثر وأعدها إلى خزانات الإسكان الخاصة بهم.
  5. صب الماء من خزان التكاثر من خلال شبكة شبكية دقيقة. انقل البيض المخصب إلى طبق بتري مع وسط الزرد E3.
  6. تحقق من طبق بتري باستخدام مجهر مجسم وتجاهل البيض الغائم. احتفظ بالبيض المخصب في وسط E3 الطازج عند 28 درجة مئوية.

3. جمع العينات

ملاحظة: ملقط الأوتوكلاف ومقبض مشرط.

  1. معالجة فورية
    1. جمع العينة الجراحية للورم في 10 مل من وسط الورم عند 4 درجات مئوية (عينة الورم يتراوح قطرها من 5 مم إلى 10 مم). انقل العينة عند 4 درجات مئوية من الموقع المطلوب للمعالجة الفورية.
  2. التخزين بين عشية وضحاها (اختياري)
    1. اجمع عينة الورم الجراحية في 10 مل من وسط الورم وقم بتخزين العينة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  3. التخزين عند -80 درجة مئوية (اختياري، أقل موصى به)
    1. قم بتخزين العينة في درجة حرارة -80 درجة مئوية في قنينة مبردة مع وسط الورم مكمل ب 5٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).

4. معالجة العينات

ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات تحت غطاء التدفق الصفحي لزراعة الأنسجة المعقمة.

  1. اغسل أنسجة الورم بالكامل ب 5 مل من وسط الورم الطازج ، مع سحب الماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات باستخدام ماصة باستور البلاستيكية. نضح وتجاهل وسط الغسيل. كرر هذه الخطوة 3x.
    ملاحظة: تجنب شفط أنسجة الورم لأنها يمكن أن تظل ملتصقة بماصة باستور البلاستيكية.
  2. انقل العينة في طبق بتري واغمرها في 1-2 مل من وسط الورم الطازج. قطع عينة الورم إلى قطع صغيرة (1-2 مم3) باستخدام شفرة مشرط ووضعها في أنبوب بلاستيكي معقم سعة 5 مل مع وسط الورم.
  3. اضبط مفرمة الأنسجة McIlwain على سمك 100 ميكرومتر. ضع شظايا العينة على الطاولة البلاستيكية الدائرية للمروحية واقطعها. قم بتدوير الطاولة بمقدار 90 درجة وكرر التقطيع.
  4. أجهزة الطرد المركزي الشظايا في 300 × غرام لمدة 3 دقائق. ثم ، استنشق بعناية طاف وتجاهله.
  5. احتضان الشظايا باستخدام جهاز تعقب الخلايا الفلورية ، CM-DiI (التركيز النهائي 10 ميكروغرام / مل في محلول ملحي مخزن بالفوسفات في Dulbecco [DPBS]) ، أحمر عميق (التركيز النهائي 1 ميكرولتر / مل في DPBS) ، أو CellTrace (التركيز النهائي 5 ميكرومتر في DPBS) لمدة 30 دقيقة ، ووضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  6. أعد تعليق الشظايا عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل كل 10 دقائق.
    ملاحظة: في حالة CellTrace ، أضف وسطا يحتوي على 1٪ بروتين على الأقل في نهاية الحضانة ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 3 دقائق والتخلص من المادة الطافية. كرر هذه الخطوة 3x مع 1 مل من DPBS لإزالة الصبغة غير المدمجة.
  8. الشظايا في 5 مل من DPBS في طبق بتري 60 مم.
    ملاحظة: تأكد من أن الأنسجة لا تجف.

5. إنشاء zPDX

ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات تحت غطاء التدفق الصفحي لزراعة الأنسجة المعقمة.

  1. تخدير الأجنة بعد يومين من الإخصاب (dpf) باستخدام 0.16 مجم / مل تريكايين في وسط الزرد E3.
  2. ضع ثلاث أسطوانات أغاروز (الخطوة 1.1.3) في طبق بتري وضع جنين الزرد على أسطوانة ، وكشف جانب واحد. قم بإزالة المحلول الزائد للحفاظ على الجنين في طبقة رقيقة فقط.
  3. انقل قطعة الأنسجة الملطخة بالملقط المعقم من طبق بتري إلى دعم الأغاروز بنسبة 1٪ حيث يرقد الجنين. التقط المنديل ، وضعه فوق صفار الجنين ، ثم ادفعه إلى الفضاء المحيط باستخدام الإبرة الزجاجية المسحوبة بالحرارة (الخطوة 1.2.1).
  4. أضف برفق بعض قطرات E3 1٪ البنسلين والستربتومايسين (Pen-Strep) إلى الجنين لإعادته إلى السائل.
  5. كرر الخطوات 5.2-5.4 لجميع الأجنة ، وأخيرا ، قم بإزالة دعامات الأغاروز من طبق بتري واحتضان الأجنة عند 35 درجة مئوية.
  6. افحص الأجنة بحثا عن الطعوم الخارجية الصحيحة (تلطيخ إيجابي) بعد 2 ساعة من الزرع باستخدام مجهر مجسم فلوري. تخلص من الأجنة التي تحتوي على شظايا الورم التي ليست داخل الفضاء المحيط بالكامل ، وكذلك الأجنة الميتة. توزيع الأجنة عشوائيا في ست لوحات متعددة الآبار (بحد أقصى n = 20 جنين / بئر) ، مقسمة بالتساوي إلى مجموعات وفقا للخطة التجريبية (على سبيل المثال ، التحكم و FOLFOXIRI).

6. العلاج

  1. خفف الدواء (على سبيل المثال ، 5-فلورويوراسيل ، أوكساليبلاتين ، إرينوتيكان) إلى E3 1٪ Pen-Strep ، واخلطه جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات. كما اقترح Usai et al.12 ، استخدم تخفيفا بمقدار خمسة أضعاف للدواء في ماء السمك ، فيما يتعلق بتركيز البلازما المكافئ (EPC).
  2. امزج الأدوية لتحضير الكوكتيل (على سبيل المثال ، FOLFOXIRI).
  3. قم بإزالة الوسائط من كل بئر وأضف كوكتيل الدواء بعد 2 ساعة من الزرع.
  4. علاج الأجنة لمدة 3 أيام. تجديد كوكتيل المخدرات كل يوم.

7. تلطيخ مناعي كامل التركيب

ملاحظة: قبل البدء ، ضع الأسيتون عند -20 درجة مئوية وقم بإعداد المحاليل المدرجة في الجدول 1.

  1. يوم 1:
    1. ثبت اليرقات ب 1 مل من 4٪ بارافورمالدهايد في قوارير زجاجية عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  2. يوم 2:
    1. اغسل اليرقات 3 × 5 دقائق مع 1 مل من برنامج تلفزيوني ، مع تحريكه بلطف على منصة مختبر الروك (400 دورة في الدقيقة).
    2. يخزن في 1 مل من الميثانول بنسبة 100٪ عند -20 درجة مئوية طوال الليل (أو للتخزين طويل الأجل).
    3. أعد ترطيب 3 × 10 دقائق باستخدام 1 مل من PTw (0.1٪ توين في برنامج تلفزيوني) ، مع التقليب بلطف على منصة مختبر الروك (400 دورة في الدقيقة).
    4. تتخلل مع 1 مل من 150 مللي متر Tris-HCl عند درجة الحموضة 8.8 لمدة 5 دقائق في RT ، تليها التدفئة لمدة 15 دقيقة عند 70 درجة مئوية.
    5. اغسل 2 × 10 دقائق ب 1 مل من PTw ، مع التقليب برفق على منصة المختبر الروك (400 دورة في الدقيقة).
    6. اغسل 2 × 5 دقائق ب 1 مل من dH2O ، مع التقليب برفق على منصة المختبر الروك (400 دورة في الدقيقة).
    7. يتخلل مع 1 مل من الأسيتون المثلج لمدة 20 دقيقة عند -20 درجة مئوية.
    8. اغسل 2 × 5 دقائق ب 1 مل من dH2O ، مع التقليب برفق على منصة المختبر الروك (400 دورة في الدقيقة).
    9. اغسل 2 × 5 دقائق ب 1 مل من PTw ، مع التقليب برفق على منصة المختبر الروك (400 دورة في الدقيقة).
    10. احتضان اليرقات في 1 مل من العازلة المانعة لمدة 3 ساعات عند 4 درجات مئوية ، مع تحريكها برفق على هزاز منصة المختبر (400 دورة في الدقيقة).
    11. ضع اليرقات في صفائح بئر مقسمة لكل مجموعة على النحو التالي: 10 يرقات في 50 ميكرولتر من الحجم / بئر في صفيحة 96 بئرا أو 20 يرقة في 100 ميكرولتر من الحجم / بئر في صفيحة 48 بئرا.
    12. تخلص من المخزن المؤقت المانع ، واحتضن اليرقات بمحلول الأجسام المضادة الأولي (على سبيل المثال ، كاسباس 3 المشقوق المضاد للأرانب ، 1: 250) المخفف في مخزن الحضانة طوال الليل عند 4 درجات مئوية في الظلام ، وهز بلطف على لوحة خفق (400 دورة في الدقيقة). راجع الخطوة 7.2.11 لمعرفة وحدات التخزين الموصى بها.
  3. يوم 3:
    1. اغسل اليرقات بالتتابع 3 × 1 ساعة مع 1 مل من PBS-TS (10٪ مصل الماعز ، 1٪ Triton X-100 في PBS) ثم ، مع 2 × 10 دقائق مع 1 مل من PBS-T (1٪ Triton X-100 في PBS) و 2 × 1 ساعة مع 1 مل من PBS-TS. في كل غسلة ، حرك بلطف الألواح التي تحتوي على اليرقات على لوحة شاكر (400 دورة في الدقيقة).
    2. احتضان اليرقات بأجسام مضادة ثانوية مترافقة صبغة الفلورسنت (على سبيل المثال ، الأجسام المضادة الثانوية المتقاطعة IgG [H + L] المضادة للماعز ، Alexa Fluor 647 ، 1: 500) و 100 ميكروغرام / مل Hoechst 33258 مخففة في مخزن الحضانة في الظلام طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، مع تحريض لطيف على لوحة شاكر (400 دورة في الدقيقة). انظر الخطوة 7.2.11 لمعرفة الكميات الموصى بها من محلول الأجسام المضادة الثانوي.
  4. يوم 4:
    1. اغسل 3 × 1 ساعة مع 1 مل من PBS-TS و 2 × 1 ساعة مع 1 مل من PTw ، مع تحريك لطيف على لوحة شاكر (400 دورة في الدقيقة).
    2. قم بإنشاء طبقة دائرية بالمينا (سمك ~ 0.5-1 مم) على شرائح المجهر. دع المينا يجف وضع اليرقات في وسط الطبقة الدائرية ، وفضح جانب الطعم الأجنبي.
    3. جفف المحلول الزائد وقم بتركيب الغطاء الزجاجي بوسط تثبيت قابل للذوبان في الماء وغير مفلور.

8. التصوير

  1. التقط الصور تحت المجهر متحد البؤر بهدف 40x. استخدم معلمات الاستحواذ التالية: دقة 1024 × 512 بكسل مع تباعد Z يبلغ 5 ميكرومتر.

9. تحليل موت الخلايا المبرمج بواسطة ImageJ

  1. تحميل (فيجي فقط) برنامج ImageJ (https://imagej.net/Fiji/Downloads) وافتح صورة ملف Z-stack (انقر فوق ملف | فتح). في النافذة المنبثقة، حدد عرض المكدس/Hyperstack وانقر فوق موافق.
  2. تراكب القنوات المختلفة عن طريق تحديد صورة | اللون | جعل مركب.
  3. اسحب شريط Z في أسفل الصورة لتصفح صورة Z-stack وتحديد منطقة xenograft (الخلايا الموجبة لتعقب الخلايا الفلورية. انظر الخطوة 4.5) في الفضاء perivitelline الزرد.
  4. حدد أداة النقطة واحسب عدد الخلايا البشرية المبرمج (موجب إلى متعقب الخلايا الفلورية و caspase-3 المشقوقة) ، كما هو موضح في الفيديو التكميلي S1.
  5. انقر نقرا مزدوجا فوق رمز أداة النقطة ، وقم بتغيير العداد ، واحسب العدد الإجمالي لنوى الخلايا البشرية (نوى الخلايا الإيجابية CM-DiI).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يصف هذا البروتوكول النهج التجريبي لإنشاء zPDXs من سرطان البنكرياس الغدي البشري الأولي. تم جمع عينة الورم وفرمها وتلطيخها باستخدام صبغة الفلورسنت ، كما هو موضح في قسم البروتوكول 4. ثم تم إنشاء zPDXs بنجاح عن طريق زرع قطعة من الورم في الفضاء المحيط لأجنة 2 من الزرد dpf ، كما هو موضح في قسم البروتوكول 5. كما هو موضح في قسم البروتوكول 6 ، تم فحص zPDXs بشكل أكبر لتحديد ملامح حساسية العلاج الكيميائي للخلايا السرطانية المشتقة من المريض. على سبيل المثال ، تم اختبار تركيبة العلاج الكيميائي FOLFOXIRI (5-فلورويوراسيل ، حمض الفولينيك ، أوكساليبلاتين ، وإرينوتيكان) ، حيث يتم استخدامه كعلاج كيميائي للخط الأول لسرطان البنكرياس الغدي القنوي المتقدم وفي سرطان القولون والمستقيم النقيلي. تم الحصول على صور كاملة التركيب ل zPDXs كمداخن Z على المجهر متحد البؤر ، وتم تحليل تحريض موت الخلايا المبرمج كما هو موضح في أقسام البروتوكول 8 و 9. كما هو موضح في الشكل 1 أ ، ب ، أدى العلاج المشترك إلى زيادة في موت الخلايا المبرمج مقارنة بالمجموعة الضابطة. في دراسة الحالة المذكورة هنا ، تم تحديد زيادة ذات دلالة إحصائية في جزء الخلايا المبرمج في الطعوم الخارجية المزروعة للمجموعة المعالجة ب FOLFOXIRI مقارنة بالمجموعة الضابطة (الشكل 1C).

Figure 1

الشكل 1: zPDXs من سرطان البنكرياس الغدي القنوي البشري بعد 3 أيام من علاج FOLFOXIRI. تم تلطيخ أغشية الخلايا ب CM-DiI (أحمر) وتم تطعيم الأنسجة ب xenografted في الفضاء المحيط ب 2 dpf AB من الزرد من النوع البري. تعرضت اليرقات لمزيج فولفوكسيري (0.216 مجم / مل 5-فلورويوراسيل ، 0.013 مجم / مل حمض الفولينيك ، 0.006 مجم / مل أوكساليبلاتين ، 0.011 مجم / مل إرينوتيكان) أو غير مكشوفة (CTRL) لمدة 3 أيام ، ثابتة ، وملطخة بالمناعة مع جسم مضاد كاسباس -3 مشقوق (سماوي) ومضادها بواسطة Hoechst (نوى زرقاء). تم تركيب اليرقات باستخدام أكوا بولي ماونت في شرائح مجهر زجاجي. (أ1-3) مثال تمثيلي ليرقة السيطرة (لا تتعرض للعلاج الكيميائي). لم يلاحظ أي خلايا إيجابية كاسباس 3 مشقوقة. (ب1-3) مثال تمثيلي ليرقة مطعمة بالأجانب بعد 3 أيام من علاج FOLFOXIRI ، تظهر تنشيطا ثابتا للكاسباس 3 المشقوق. تم التقاط صور كاملة التركيب على مجهر نيكون A1 متحد البؤر مزود بكاميرا رقمية. تظهر الخطوط المتقطعة مناطق الكسب غير المشروع. (ج) التحديد الكمي للخلايا المزدوجة المشقوقة caspase-3 و CM-DiI في اليرقات المطعمة بالأجانب المعالجة ب FOLFOXIRI مقارنة ب CTRL ، مرسومة كمتوسط ± SEM (n ≥ 12) ؛ p < 0.001 ، اختبار مان ويتني يو. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: zPDX = xenograft مشتق من مريض الزرد ؛ dpf = أيام بعد الإخصاب ؛ فولفوكسيري = 5-فلورويوراسيل ، حمض الفولينيك ، أوكساليبلاتين ، وإرينوتيكان ؛ CTRL = عنصر تحكم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الحل / الوسط التكوين والتعليقات قصد
وسط الورم (1x) إلى وسط RPMI-1640 ، أضف البنسلين - الستربتومايسين (التركيز النهائي 100 وحدة / مل) والأمفوتريسين (التركيز النهائي 2.50 ميكروغرام / مل).
E3 الزرد المتوسطة (1x) قم بتخفيف وسط الجنين 60x E3 (كلوريد الصوديوم 3 M ، KCl 0.1 M ، CaCl 2 0.2 M ، MgSO4 0.2 M) في الماء منزوع الأيونات إلى تركيز عمل نهائي قدره 1x.
E3 1٪ قلم بكتيريا أضف 1 مل من البنسلين والستربتومايسين إلى 99 مل من وسط E3 الزرد. تخلط عن طريق الانقلاب. قم بتخزين المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية
بتواء 0.1٪ توين في برنامج تلفزيوني تلطيخ مناعي كامل
حظر المخزن المؤقت 10٪ مصل الماعز ، 1٪ DMSO ، 1٪ BSA ، 0.8٪ Triton X-100 في PTw تلطيخ مناعي كامل
العازلة الحضانة 1٪ مصل الماعز ، 1٪ DMSO ، 1٪ BSA ، 0.8٪ Triton X-100 في PTw تلطيخ مناعي كامل
برنامج تلفزيوني-TS 10٪ مصل الماعز ، 1٪ Triton X-100 في PBS تلطيخ مناعي كامل
برنامج تلفزيوني-تي 1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني تلطيخ مناعي كامل

الجدول 1: الحلول والوسائط المستخدمة في البروتوكول.

الشكل التكميلي S1: كانت عينة ورم PDAC ملطخة ب DiO (خضراء) ومطعمة ب xenografted في الفضاء المحيط ل 2 من أجنة الزرد dpf.بعد فترة حضانة لمدة 3 أيام ، تم حقن zPDXs ب 2 ميكروغرام / مل من يوديد البروبيديوم (PI ؛ أحمر) ثم تعرضوا للتصوير ثلاثي البؤر ثلاثي الأبعاد. تم التحقق من صلاحية الخلية عن طريق قياس الخلايا الإيجابية PI من إجمالي عدد الخلايا البشرية (DiO إيجابية). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الاختصارات: PDAC = سرطان الغدة البنكرياسية. dpf = أيام بعد الإخصاب ؛ zPDX = طعم xenograft مشتق من مريض الزرد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي S1: مثال على عد الخلايا البشرية المبرمج ، باستخدام أداة متعددة النقاط من ImageJ. الفيديو عبارة عن مكدس Z ل zPDX بعد 3 أيام من الزرع ، تم الحصول عليه بعد الشق caspase-3 و Hoechst 33258 immunostaining. الاختصارات: zPDX = طعم xenograft مشتق من مريض الزرد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توفر النماذج في الجسم الحي في أبحاث السرطان أدوات لا تقدر بثمن لفهم بيولوجيا السرطان والتنبؤ باستجابة علاج السرطان. حاليا ، تتوفر نماذج مختلفة في الجسم الحي ، على سبيل المثال ، الحيوانات المعدلة وراثيا (الفئران المعدلة وراثيا والضربة القاضية) أو الطعوم الخارجية المشتقة من المريض من الخلايا الأولية البشرية. على الرغم من العديد من الميزات المثلى ، كل واحد له قيود مختلفة. على وجه الخصوص ، تفتقر النماذج المذكورة أعلاه إلى طريقة موثوقة لتقليد البيئة المكروية لأنسجة الورم المريض.

وقد اقترح أن البيئة المكروية للورم قد تلعب العديد من الأدوار الهامة في الاستجابة للأدوية18. لذلك ، للعثور على نموذج حيواني مناسب يحافظ على البيئة المكروية لأنسجة الورم ، تم تطوير نموذج PDX بديل ، باستخدام قطع من أنسجة الورم المطعمة ب 2 من أجنة الزرد dpf. يصف البروتوكول كيفية إجراء الطعوم الخارجية في عدد كبير من الأجنة ، مما يسمح بفحص الأدوية عالية الإنتاجية ، سواء كعوامل مفردة أو في مجموعات.

النقطة الأساسية في هذا النهج المبتكر هي أنه يحافظ على كل من تفاعلات الخلايا الخلوية والبيئة المكروية للورم ، مقارنة ب zPDXs التي يتم إجراؤها بشكل شائع مع تعليق خلية واحدة. يتم وضع PDAC من عينة جراحية على الفور في وسائط الورم الطازجة والباردة ، ويتم تقطيع الورم إلى شظايا صغيرة. يعتمد الإجراء العام المستخدم لإنشاء نموذج zPDX على الزرع المباشر لجزء من ورم المريض في الفضاء المحيط لجنين الزرد 2 dpf.

يمكن أن يكون النموذج المقترح بمثابة بديل لنموذج PDX بناء على هضم عينة أنسجة الورم المشتقة من المريض ، يليها الحقن المباشر في كيس الصفار أو في الفضاء المحيطي. كما يتضح من عمل Fior et al. ، من الممكن إنشاء نموذج zAvatar من التشريح الأنزيمي لسرطانات البنكرياس المقطوعة جراحيا. تراوح معدل الزرع بين 44٪ و 64٪ ، بسبب انخفاض الخلوية النموذجية لعينة البنكرياس الورمية وسدى التنسج الكثيفغير المواتي 19.

ومع ذلك ، فإن تعليق الخلية أعاد إنتاج الورم الأصلي14 جزئيا فقط. على العكس من ذلك ، فإن mPDX ، الذي تم إنشاؤه عن طريق زرع أنسجة الورم مباشرة في الفئران التي تعاني من نقص المناعة ، يشبه بشكل أفضل الورم الأصلي ، والذي يمكن أن يساعد الأطباء بشكل أفضل على فهم سلوك الورم وتقييم الاستجابات الفردية قبل العلاج20. في الواقع ، يحافظ الجزء الصغير المنقوش على البيئة المكروية للورم ويحافظ على الحديث المتبادل بين الخلايا الخبيثة والسليمة ، على غرار الورم الأصلي21. وبالتالي يتم استنساخ الحساسية الكيميائية أو المقاومة الكيميائية بشكل أفضل ، مع تأثير مباشر لتقنية zPDX في مجال علم الأورام الانتقالي14. يتيح نهج zPDX لكل مريض تطوير الورم الخاص به في نظام حي. وبالتالي ، فإن هذا يمثل بديلا جيدا لاستخدام mPDX ، حيث يتم تطعيم أنسجة الورم سليمة أو مجزأة في الخلايا ، والتي يتم بعد ذلك تطعيمها بالأشعة السينية في نماذج مستقبل الفئران13.

تم تطوير هذا البروتوكول بالتعاون مع أخصائيي علم الأمراض المسؤولين عن اختيار أنسب قطع الورم للزراعة. لطالما تم أخذ عينات الأنسجة البيولوجية من العينة الجراحية وليس من الخزعة ، حيث تتميز الأخيرة عادة بندرة الأنسجة وبالتالي فهي مخصصة لأغراض التشخيص فقط. عادة ما لا يكون معيار أخذ عينات الأنسجة هامشيا مقابل اللب ، بل منطقة ورم خالية من النزيف والنخر. لهذا السبب ، تم دائما إجراء قسم نسيجي بالتبريد على نصف العينة لمراقبة الجودة الفورية للمادة. يمكن أن تكون الدراسة الحالية محدودة بقدرة الخلايا السرطانية الأولية على الانغماس في الفضاء المحيط بأجنة الزرد. ومع ذلك ، لوحظ معدل تطعيم بنسبة 80٪ للأنسجة القابلة للحياة بعد 3 أيام من الزرع ، بعد التخزين عند 4 درجات مئوية (12/15 حالة) وإذابة الجليد من -80 درجة مئوية (10/12 حالة) ، مما يشير إلى أنه يمكن حفظ الورم بالتبريد بشكل فعال ، مع بقاء الخلية بنسبة 74٪ ± 2٪ (الشكل التكميلي S1). على الرغم من ذلك ، فإن معدل نجاح نقش الأنسجة يختلف بين أورام مريض PDAC المختلفة. وبالتالي ، فإن المعالجة السريعة للأنسجة بعد فترة وجيزة من الاستئصال الجراحي ، وكذلك منع التجميد ، يمكن أن تعزز الكفاءة.

كما تم اقتراح بعض الوسائل التقنية في البروتوكول لنجاح الطعوم الخارجية. على سبيل المثال ، أدى استخدام المروحية إلى توحيد أبعاد القطع المطعمة بالخارج. للتحقق من أن قطع أنسجة الورم متساوية في الأبعاد بعد التقطيع ، فإن الحل المحتمل هو استخدام زجاج معايرة لقياس قطر الشظايا قبل زرع الأعضاء.

يعد استخدام دعامة أسطوانة الأغاروز بنسبة 1٪ أمرا ضروريا لوضع الأجنة على جانب واحد وزرع قطعة من الورم ببساطة ، وكذلك لمنع كسر الإبرة الدقيقة. نظرا لأن الأورام تظهر تقلبا كبيرا ، فإن هناك قيودا أخرى على الطريقة وهي أن عدم التجانس داخل الورم يكون أقل تمثيلا في جزء مقارنة بالتعليق الخلوي. في الواقع ، يمكن أن تتباعد قطع الأنسجة الصغيرة من حيث مجموعات الخلايا الحميدة واستنساخ الورم الفرعي. للتغلب على هذا النقد ، يجب استخدام عدد كبير من الأجنة المحقونة لتلخيص عدم تجانس الورم وتقليل التباين في التحليل. وفقا للتحليل الإحصائي ، تتطلب كل مجموعة حجم عينة أكبر من 15 ، مع الأخذ في الاعتبار حجم تأثير d = 2 ، وقوة 80٪ و 95٪ أهمية إحصائية. هذا الرقم معقول ، حيث يمكن للمشغل الخبير معالجة حوالي 40 جنينا في الساعة.

بالإضافة إلى المنهجية المستخدمة لإنشاء نموذج zPDX ، فقد ثبت هنا أيضا أن تركيبة FOLFOXIRI تحفز موت الخلايا المبرمج للخلايا المشتقة من المريض في نموذج zPDX. كما هو الحال مع FOLFOXIRI ، من الممكن اختبار الحساسية الكيميائية zPDX لمخططات العلاج الكيميائي الأخرى ، مثل تلك التي تم اختبارها بنجاح بواسطة Usai et al.11.

بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم تقنية التلوين المناعي والتصوير الكامل لتوفير القياس الكمي لميزة الاهتمام. للتغلب على بعض المشاكل وتؤدي إلى تلطيخ مناعي ناجح كامل ، يوصى باستخدام محلول DMSO بنسبة 5٪ لاختراق الأنسجة. فيما يتعلق بالتصوير متحد البؤر ، يمكن أن تؤدي قيود دقة المجهر متحد البؤر إلى إضعاف اكتساب الأكوام العميقة لليرقات المطعمة بالأجانب. ومع ذلك ، في الدراسة ، يتم حساب الخلايا المبرمج من إجمالي عدد خلايا المريض. تتيح إعادة البناء ثلاثية الأبعاد من القاعدة إلى أعلى كتلة الورم المزروعة ، بحجم خطوة يبلغ 5 ميكرومتر ، تحديد جميع النوى البشرية ، مع الأخذ في الاعتبار احتمال انتشار نفس النواة داخل المستوى Z السابق أو التالي. وبالتالي ، يمكن استخدام عداد الأدوات متعدد النقاط ImageJ للتحكم في نفس الخلية ومنعها مرتين ولتشغيل العد المزدوج في نفس مكدسات Z (موت الخلايا المبرمج من إجمالي الخلايا البشرية) ويمكنه بسهولة تتبع موت الخلايا المبرمج على مستوى الخلية الواحدة.

على الرغم من قيوده ، فإن نموذج zPDX له العديد من المزايا مقارنة بالنماذج في الجسم الحي : دورة الحياة السريعة للغاية لسمك الزرد ، والقدرة على الحصول على أعداد كبيرة من الحيوانات في وقت قصير. الوضوح البصري في مراحل التطوير ؛ وقبل كل شيء ، التأثير الأخلاقي المنخفض للغاية في النافذة الزمنية بعد الإخصاب 0-120ساعة 22. اليوم ، تعد التجربة السريرية المشتركة باستخدام zPDXs أرخص من تلك التي أجريت باستخدام PDXs القائمة على الماوس ، لأن سلالات المضيف التي تعاني من نقص المناعة تتطلب تكلفة عالية للصيانة بالإضافة إلى طرق تصوير معقدة لمراقبة نمو الورم23. في الختام ، تسلط كل هذه العوامل الضوء على إمكانات نموذج zPDX للاستخدام في التجارب السريرية المشتركة للتنبؤ بملامح حساسية العلاج الكيميائي لمرضى السرطان وللاستخدام من قبل الباحثين المهتمين بنماذج جديدة لفحص الأدوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة بيزا (المشروع 114/16). يود المؤلفون أن يشكروا رافاييل جيتا من وحدة علم أمراض الأنسجة في Azienda Ospedaliera Pisana على اختيار عينة المريض ودعم علم الأمراض. كما نشكر أليسيا جالانتي على الدعم الفني في التجارب. تستند هذه المقالة إلى عمل من COST Action TRANSPAN ، CA21116 ، بدعم من COST (التعاون الأوروبي في العلوم والتكنولوجيا).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-fluorouracil Teva Pharma AG SMP 1532755
48 multiwell plate Sarstedt 83 3923
96 multiwell plate Sarstedt 82.1581.001
Acetone Merck 179124
Agarose powder  Merck A9539
Amphotericin Thermo Fisher Scientific 15290018
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 Merck MAB1281  1:200 dilution
Aquarium net QN6 Penn-plax 0-30172-23006-6
BSA Merck A9418
CellTrace Thermo Fisher Scientific C34567
CellTracker CM-DiI  Thermo Fisher Scientific C7001
CellTracker Deep Red  Thermo Fisher Scientific C34565
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 9661S 1:250 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)  PanReac AppliChem ITW Reagents A3672,0250
Dumont #5 forceps World Precision Instruments 501985
Folinic acid -  Lederfolin Pfizer
Glass capillaries, 3.5" Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. 
Glass vials  VWR International WHEAW224581
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Thermo Fisher Scientific A-21244   1:500 dilution
Goat serum Thermo Fisher Scientific 31872
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570
Irinotecan Hospira
Low Temperature Freezer Vials VWR International 479-1220
McIlwain Tissue Chopper World Precision Instruments
Microplate Mixer SCILOGEX 822000049999
Oxaliplatin Teva
Paraformaldehyde Merck P6148-500G
PBS Thermo Fisher Scientific 14190094
Penicillin-streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140122
Petri dish 100 mm Sarstedt 83 3902500
Petri dish 60 mm Sarstedt 83 3901
Plastic Pasteur pipette Sarstedt 86.1171.010
Poly-Mount Tebu-bio 18606-5
Propidium iodide Merck P4170
RPMI-1640 medium Thermo Fisher Scientific 11875093
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel VWR International SWAN3001
Scalpel handle #3 World Precision Instruments 500236
Tricaine Merck E10521
Triton X-100  Merck T8787
Tween 20 Merck P9416
Vertical Micropipette Puller Shutter instrument P-30 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubin, H. Understanding cancer. Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).
  2. Krzyszczyk, P., et al. The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment. Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).
  3. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
  4. Trunk, A., et al. Emerging treatment strategies in pancreatic cancer. Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).
  5. Moffat, G. T., Epstein, A. S., O'Reilly, E. M. Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care. Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).
  6. Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).
  7. Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
  8. Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
  9. Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
  10. Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).
  11. Usai, A., et al. Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients. Cancers. 13 (16), 4131 (2021).
  12. Usai, A., et al. A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials. Cancers. 12 (3), 677 (2020).
  13. Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).
  14. Miserocchi, G., et al. Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).
  15. Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
  16. Albini, A., et al. Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity. Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).
  17. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
  18. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  19. Tavares Barroso, M., et al. Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening. Cells. 10 (8), 2077 (2021).
  20. Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men. Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).
  21. Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment. Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).
  22. Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
  23. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).

Tags

أبحاث السرطان ، العدد 195 ، الصورة الرمزية لسمك الزرد ، النموذج قبل السريري ، التجربة السريرية المشتركة ، زرع الورم ، الحساسية الكيميائية ، التألق المناعي الكامل
إنشاء الطعوم الخارجية المشتقة من مريض الزرد من سرطان البنكرياس لاختبار الحساسية الكيميائية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Usai, A., Di Franco, G., Gabellini,… More

Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing. J. Vis. Exp. (195), e63744, doi:10.3791/63744 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter