Qui forniamo una procedura dettagliata per la produzione, la purificazione e la quantificazione del virus della malattia di Newcastle ricombinante ad alto titolo. Questo protocollo produce costantemente > 6 × 109 unità di formazione della placca / mL, fornendo quantità di virus appropriate per studi su animali in vivo . Vengono descritti ulteriori saggi di controllo della qualità per garantire la sicurezza in vivo .
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Articolo metodologico
Produzione di virus della malattia di Newcastle ricombinante ad alto titolo dal liquido allantoico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il virus della malattia di Newcastle (NDV), noto anche come sierotipo 1 dell'ortoavulavirus aviario, è un virus a RNA a singolo filamento a senso negativo che è stato sviluppato sia come virus oncolitico che come vaccino vettore virale. NDV è un attraente agente terapeutico e profilattico grazie al suo consolidato sistema di genetica inversa, potenti proprietà immunostimolanti e un eccellente profilo di sicurezza. Quando somministrato come virus oncolitico o vaccino vettore virale, NDV suscita una robusta risposta immunitaria antitumorale o antigene-specifica, attivando sia il braccio innato che quello adattativo del sistema immunitario.
Date queste caratteristiche desiderabili, NDV è stato valutato in numerosi studi clinici ed è uno dei virus oncolitici più ben studiati. Attualmente, ci sono due studi clinici registrati che coinvolgono NDV: uno che valuta un vaccino ricombinante NDV-vectored per SARS-CoV-2 (NCT04871737), e un secondo che valuta un NDV ricombinante che codifica per Interleuchina-12 in combinazione con Durvalumab, un anticorpo antiPD-L1 (NCT04613492). Per facilitare l'ulteriore avanzamento di questo vettore virale altamente promettente, sono necessari metodi semplificati per generare NDV ricombinante (rNDV) ad alto titolo, di grado vivo.
Questo documento descrive una procedura dettagliata per amplificare l'rNDV in uova di gallina embrionate prive di patogeni specifici (SPF) e purificare l'rNDV dal liquido allantoico, con miglioramenti per ridurre la perdita durante la purificazione. Sono incluse anche le descrizioni dei test di controllo di qualità raccomandati, che dovrebbero essere eseguiti per confermare la mancanza di contaminanti e l'integrità del virus. Nel complesso, questa procedura dettagliata consente la sintesi, la purificazione e la conservazione di NDV ad alto titolo, di grado vivo, ricombinante, lentogeno e mesogenico per l'uso in studi preclinici.
Introduzione
Newcastle Disease Virus, noto anche come Avian Orthoavulavirus-1, è un paramixovirus aviario avvolto con il potenziale per essere utilizzato sia come virus oncolitico che come vaccino viralevettore 1,2,3,4,5,6,7. Più recentemente, NDV progettato per esprimere la proteina spike di SARS-CoV-2 è stato caratterizzato come un vaccino intranasale efficace nei modellidi sfida di topo e criceto
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Protocollo
Tutto il lavoro che coinvolge l'uso di animali è stato approvato dal Comitato per la cura degli animali dell'Università di Guelph in conformità con il Canadian Council on Animal Care. Tutto il lavoro viene eseguito in un laboratorio di livello di biosicurezza 2 (BSL2) in Canada, dove l'NDV mesogenico è un agente patogeno del gruppo di rischio 2. Tutte le fasi coinvolte nell'amplificazione e purificazione di NDV devono essere eseguite in un armadio di sicurezza biologica di tipo IIA per scopi di sicurezza e sterilità.
1. Amplificazione di NDV mediante uova di gallina embrionate esenti da agenti patogeni specifici
- I....
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Risultati
Raccolta del fluido allantoico
Poiché il liquido allantoico viene raccolto da uova di gallina embrionate, dovrebbe apparire chiaro e trasparente. Se il fluido appare opaco e giallo, questo indica la presenza di contaminanti. L'inclusione di questo fluido allantoico durante la purificazione impedirà il processo di purificazione, poiché la pressione aumenterà rapidamente e supererà i 10 psi, con conseguente taglio del virus e perdita del virus infettivo. Il liquido allantoico che appare sanguinante sugg.......
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Discussione
I virus utilizzati come agenti terapeutici negli studi preclinici devono essere altamente purificati per evitare tossicità quando somministrati in vivo15. Se agenti avventizi o contaminanti non vengono rimossi, ciò può portare a gravi reazioni avverse che negano l'effetto terapeutico dell'agente virale28. Poiché l'NDV è prodotto in uova di gallina embrionate, ci sono diverse proteine dell'uovo contaminanti, come l'ovalbumina, che devono essere rimosse prima del suo.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
J.G.E.Y è stato il destinatario di una borsa di studio di dottorato dell'Ontario Veterinary College e di una borsa di studio per laureati dell'Ontario. Questo lavoro è stato finanziato dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants a SKW (grant #304737) e LS (grant #401127).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,25% Tripsina | HyClone | SH30042.02 | |
| Siringa a punta scorrevole da 1 mL | BD | 309659 | |
| Siringa Luer-Lok da 10 mL | BD | 302995 Soluzione di | |
| iodio povidone al 10% | LORIS | 109-08 | |
| Provette coniche da 15 mL | Thermo-Fisher | 14955240 | |
| 18G x 1 1/2 in Ago di riempimento smussato | BD | 305180 | |
| Ago di scorrimento di precisione da 18 G x 1 1/2 pollici | BD | 305196 | |
| Ago da 25 g x 5/8 pollici | BD | 305122 | |
| 2-Mercaptoetanolo | Thermo-Fisher | 03446I-100 | |
| Soluzione di acrilammide/Bis al 30% 37,5:1 | BioRad | 1610158 | |
| 4% Paraformaldeide-PBS | Thermo-Fisher | J19943-K2 | |
| 5 mL Siringa Luer-Lok | BD | 309646 | |
| Piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti - Fondo piatto | Greiner Bio One | 655180 | |
| Acido acetico, Thermo-Fisher glaciale | A38-212 | ||
| Agarosio | Froggabio | A87-500G | |
| Alexa-Fluor 488 Capra-Anti-Topo | Invitrogen | A11001 | |
| Allegra X-14 Centrifuga | Beckman Coltro | B08861 | |
| Persolfato di ammonio | BioRad | 161-0700 | |
| Candeggina (5%) | Thermo-Fisher | 36-102-0599 | |
| Pinza larga con punta non seghettata | Thermo-Fisher | 09-753-50 | |
| Blu bromofenolo | Sigma-Aldrich | 114405-25G | |
| Porta cassetta centramato | PALL | CM018V | |
| ChemiDoc XRS+ | BioRad | 1708265 | |
| CO2 Incubatrice | Thermo-Fisher | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-259 | Thermo-Fisher | BP101-50 | |
| DF1 Cellule | ATCC | CRL-12203 | |
| Diet Gel Recovery | ClearH2O, INC | 72-01-1062 | |
| Incubatrice per uova Sportsman digitale 1502 | Berry Hill | 1502W | |
| D-mannitolo | Sigma-Aldrich | M4125-500G | |
| Candelabro per uova | Berry Hill | A46 | |
| Etanolo (70%) | Thermo-Fisher | BP82031GAL | |
| Soluzione di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), pH 8,0, 0,5 M in H2O | Thermo-Fisher | BP2482-500 | |
| Raccordi a T filettati femmina, nylon, 1/8 in NPT(F) | Cole-Parmer | 06349-50 | |
| Siero fetale bovino | Gibco | 12483-020 | |
| Pinze ad alta precisione a punta fine | Thermo-Fisher | 22-327379 | |
| Microscopio fluorescente | ZEISS AXIO | Non necessario se non si esegue l'IFA o se NDV non codifica una proteina fluorescente | |
| Sistema di liofilizzazione Freezone 4.5 | LABCONCO | ||
| GiBOX Gel Imager | Syngene | Imaging di gel di agarosio | |
| Glicerolo | Thermo-Fisher | G33-1 | |
| Glicina | Thermo-Fisher | BP381-5 | |
| Kit di trascrittasi inversa cDNA ad alta capacità | Thermo-Fisher | 4368814 | |
| Alto glucosio Dulbecco's Essential Medium Cytiva | SH30022.01 | ||
| Kit umidità | Berry Hill | 3030 | |
| Iodixanol | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (p/v) soluzione di iodixanolo in acqua (sterile) |
| L-lisina monocloridrato | Sigma-Aldrich | 62929-100G-F | |
| maschio e femmina Luer-Lok a 1/8 in filettatura nazionale per tubi, NPT | Cole-Parmer | 41507-44 | |
| Masterflex L/S Digital | Drive Cole-Parmer | RK-07522-20 | Pompa peristaltica con display digitale |
| Masterflex L/S Easy Load Testa della pompa per tubi di precisione | Cole-Parmer | RK-07514-10 | |
| Tubo in silicone Masterflex (Platinum) L/S 16 | Cole-Parmer | 96420-16 | BioPharm Silicone polimerizzato al platino |
| MC Pro 5 Thermocycler | Eppendorf | EP950040025 | |
| Metanolo | Thermo-Fisher | A412-4 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | SDS-PAGE cast e running appartus |
| Mouse-Anti-NDV | Novus Biologicals | NBP2-11633 | Clone 6H12 |
| Siero di capra normale | Abcam | AB7481 | |
| NP-40 | Thermo-Fisher | 85124 | |
| Membrana Omega LV Centramate Cassette, 100K | PALL | OS100T02 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuga | Beckman Coltro | A94471 | |
| OWL Easycast B1A Mini Sistema di elettroforesi su gel | Thermo-Fisher | B1A | |
| PBS 10X Soluzione | Thermo-Fisher | BP399-20 | |
| Poli(glicole etilenico) Media Mn 20.000 | Sigma-Aldrich | 81300-1KG | |
| PowePac 300 | BioRad | Modello 1655050 - per elettroforesi su gel di agarosio | |
| Q5 Alta fedeltà 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| QIA Amp Mini kit di RNA virale | Qiagen | 52904 | |
| RedSafe | Thermo-Fisher | 50999562 | |
| Slide-a-lyzer Cassetta per dialisi (forza extra), 10.000 MWCO 0,5-3 mL | Thermo-Fisher | 66380 | |
| Sodio dodecil solfato | Thermo-Fisher | BP166-500 | |
| Idrossido di sodio (pellet) | Thermo-Fisher | S318-10 | |
| Uova prive di agenti patogeni specifici | CFIA | NA | Il fornitore varierà a seconda della posizione |
| Saccarosio | Thermo-Fisher | S5-3 | |
| Supracap 50 Filtro di profondità | PALL | SC050V100P | |
| Forbici | chirurgicheThermo-Fisher | 08-951-5 | |
| Sw41Ti Rotore | Coltro Beckman | 331362 | Utilizzato nelle fasi di protocollo 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7 |
| SX4750 Rotore | Coltro Beckman | 369702 | |
| Adattatore SxX4750 per provette a fondo conciale | Coltro Beckman | 359472 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | |
| Provette da centrifuga ultratrasparenti a parete sottile ( 9/16 pollici x 3 1/2 pollici) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris Base | Thermo-Fisher | BP152-5 | |
| Morsetto a vite per tubi | PALL | 88216 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-1L | |
| Manometri di utilità | Cole-Parmer | 68355-06 |
Riferimenti
- Kim, S. H., Samal, S. K. Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines. Viruses. 8 (7), (2016).
- Kortekaas, J., et al. Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector. V....
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Ristampe e permessi
