Подготовка седалищного нерва крысы к нейрофизиологии Ex Vivo
Summary
Этот протокол описывает подготовку всей седалищной нервной ткани крысы к электрофизиологической стимуляции ex vivo и запись в экологически регулируемую двухкамерную перфузированную солевую ванну.
Abstract
Препараты ex vivo позволяют изучать многие нейрофизиологические процессы в отрыве от остального организма при сохранении местной тканевой структуры. Эта работа описывает подготовку седалищных нервов крыс для нейрофизиологии ex vivo, включая буферную подготовку, процедуры для животных, настройку оборудования и нейрофизиологическую запись. В этой работе представлен обзор различных типов экспериментов, возможных с помощью этого метода. Описанный метод направлен на обеспечение 6 ч стимуляции и записи на извлеченной периферической нервной ткани в жестко контролируемых условиях для оптимальной согласованности результатов. Результаты, полученные с помощью этого метода, представляют собой потенциалы действия соединения А-волокна (CAP) с амплитудами от пика до пика в диапазоне милливольт в течение всей продолжительности эксперимента. Амплитуды и формы CAP являются последовательными и надежными, что делает их полезными для тестирования и сравнения новых электродов с существующими моделями или эффектами вмешательств на ткани, такими как использование химических веществ, хирургических изменений или методов нейромодулирующей стимуляции. Как обычные коммерчески доступные манжеты с платино-иридиевыми контактами, так и изготовленные на заказ проводящие эластомерные электроды были протестированы и дали аналогичные результаты с точки зрения реакции силы и продолжительности нервного стимула.
Introduction
Современное понимание фундаментальной функции нерва, смоделированной in silico , отсутствует в нескольких аспектах, особенно в отношении эффектов компартментализации нервной ткани за пределами сомы, аксона и дендритов. Взаимодействия аксон-миелин все еще плохо изучены, о чем свидетельствует тот факт, что даже подробные вычислительные модели нервов, такие как MRG1 (для нервов млекопитающих), которые адекватно захватывают обычный ответ электрической стимуляции, не фиксируют другие экспериментально наблюдаемые модели поведения, такие как перенос высокочастотного блока2 или вторичный ответ начала3.
Этот протокол обеспечивает метод эффективного исследования нейрофизиологических процессов на нервном уровне в острой модели малых лабораторных животных, используя стандартизированный протокол подготовки для изоляции нерва, контроля его окружающей среды и удаления его из контекста in vivo в контекст ex vivo. Это предотвратит другие процессы в организме или анестетики, используемые протоколами стимуляции нервов in vivo для изменения поведения нервов и искажения измеренных результатов или их интерпретации 4,5. Это позволяет разрабатывать более реалистичные модели, ориентированные исключительно на эффекты, специфичные для нервных тканей, которые плохо изучены. Этот протокол также полезен в качестве испытательного стенда для новой стимуляции нервов и регистрации электродных материалов и геометрии, а также новых парадигм стимуляции, таких как высокочастотный блок 2,3. Вариации этого метода ранее использовались для изучения физиологии нервов в жестко контролируемых условиях6, например, для измерения динамики и свойств ионных каналов или эффектов местных анестетиков7.
Этот метод обеспечивает несколько преимуществ по сравнению с альтернативами, такими как острые эксперименты in vivo на мелких животных8. Этот метод устраняет необходимость поддержания глубины анестезии, поскольку ткань была извлечена из организма, уменьшая количество необходимого оборудования, такого как диффузор анестезии, концентратор кислорода и грелка. Это упрощает экспериментальный протокол, снижая риск ошибок. Поскольку анестетики могут потенциально изменять функцию нерва4, этот метод гарантирует, что меры не будут смешаны побочными эффектами от этих анестезирующих соединений. Наконец, этот метод более уместен, чем острые эксперименты in vivo при изучении эффектов нейротоксичных соединений, таких как тетродотоксин, которые убивают обезболенное животное параличом.
Периферические нервные участки являются уникальной системой ex vivo , поскольку существует высокая вероятность того, что волокна, ответственные за записанные нейронные сигналы, не содержат никакой сомы. Поскольку они обычно расположены, для двигательных нейронов в позвоночнике и для сенсорных нейронов в дорсальных корневых ганглиях рядом с позвоночником, подготовка участка нерва млекопитающих может быть грубо смоделирована как набор трубчатых мембран с ионными каналами, открытыми на обоих концах9. Метаболизм поддерживается митохондриями, расположенными в аксоне в момент рассечения ткани10. Швы открытых концов аксолеммы поощряются после экстракции, чтобы закрыть их и тем самым помочь поддерживать существующие ионные градиенты по всей мембране, которые необходимы для нормальной функции нерва.
Чтобы поддерживать тканевый гомеостаз вне организма, необходимо жестко контролировать несколько переменных окружающей среды. Это температура11, оксигенация12, осмолярность, рН13,14 и доступ к глюкозе для поддержания метаболизма. Для этого протокола подход заключается в использовании модифицированного буфера Кребса-Хенселейта15,16 (mKHB), непрерывно аэрированного смесью кислорода и углекислого газа. MKHB относится к семейству кардиоплегических буферов 6,17, используемых для сохранения рассеченных тканей вне организма, например, в экспериментах ex vivo. Эти буферы не содержат гемоглобина, антибиотиков или противогрибковых препаратов и, следовательно, подходят только для препаратов с участием небольших количеств ткани в течение ограниченного времени. Контроль pH был достигнут с помощью карбонатной и углекислотной окислительно-восстановительной пары, требующей постоянной аэрации буфера углекислым газом для поддержания равновесия рН. Это делается для того, чтобы избежать использования других распространенных буферных агентов, таких как HEPES, которые могут модифицировать функцию нервных клеток18. Для насыщения буфера кислородом и обеспечения контроля рН использовалась смесь 5% углекислого газа в кислороде, называемая карбогеном (95% O2, 5% CO2). Нагревательную мешалку использовали для контроля температуры буферного контейнера, и буфер перфузировали через нервную ванну, а затем рециркулировали в исходный контейнер. Типичный эксперимент будет длиться 6-8 часов, прежде чем нерв потеряет свою жизнеспособность и больше не будет достаточно реагировать на стимуляцию, чтобы меры были репрезентативными для здоровой ткани.
Для оптимизации отношения сигнал/шум для записи использовали серебристо-хлоридные электроды, которые готовили согласно ранее описанным способам19. Для стимуляции может использоваться комбинация коммерческих готовых платиновых манжетных электродов и изготовленных на заказ проводящих полимерных манжетных электродов. Проводящие полимерные манжеты электроды имеют заметно более высокую емкость заряда, которые полезны при стимуляции нерва с использованием высокоамплитудных сигналов20.
Стимулятор, используемый в этом протоколе, был ранее описан20. Документация, файлы проектирования и программные сценарии для его использования являются общедоступными21. Другие стимуляторы могут быть использованы для выполнения этого протокола; однако пользовательский стимулятор также способен использовать блок2,20 высокочастотного альтернативного тока (HFAC), что позволяет проводить более широкий спектр нейрофизиологических экспериментов. Для использования блока HFAC рекомендуются проводящие эластомерные манжеты, чтобы избежать повреждения нерва. Манжеты проводящих эластомерных нервов представляют собой мягкие и полностью полимерные электродные массивы, изготовленные из проводящих эластомеров в качестве проводящего компонента и полидиметилсилоксана в качестве изоляции22. Устройства были изготовлены в биполярной конфигурации с использованием обычных методов лазерного микропроизводства.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой работе мы описали протокол подготовки седалищных нервов крыс для нейрофизиологии ex vivo. Экстракция тканей занимает около 30 минут, включая обработку животных, анестезию, выбраковку и рассечение, в то время как очистка нервов, помещение в ванну и имплантация электрода должны п?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают признательность доктору Джеральду Хансбергеру из GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, king of Prussia, PA, США и Galvani Bioelectronics (Stevenage, UK) за то, что они поделились с нами своей оригинальной техникой подготовки нервов. Авторы признают Роберта Тота за дизайн двухкамерной нервной ванны. Авторы признают финансирование из гранта Healthcare Technologies Challenge Awards (HTCA) Исследовательского совета по инженерным и физическим наукам (EPSRC). Авторы выражают признательность Центру высокопроизводительных встраиваемых и распределенных систем для докторантуры (HiPEDS CDT) Имперского колледжа Лондона за финансирование Adrien Rapeaux (EP/L016796/1). Adrien Rapeaux в настоящее время финансируется Британским научно-исследовательским институтом деменции, Научно-исследовательским и технологическим центром ухода. Авторы с благодарностью отмечают Зака Бейли из Имперского колледжа на кафедре биоинженерии за помощь в экспериментах и доступ к тканям животных во время производства видеостатьи JoVE.
Materials
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
Riferimenti
- McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle. Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).
- Pelot, N. A., Grill, W. M. In vivo quantification of excitation and kilohertz frequency block of the rat vagus nerve. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026005 (2020).
- Patel, Y. A., Kim, B. S., Rountree, W. S., Butera, R. J. Kilohertz electrical stimulation nerve conduction block: Effects of electrode surface area. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 25 (10), 1906-1916 (2017).
- Kortelainen, J., Al-Nashash, H., Vipin, A., Thow, X. Y., All, A. The effect of anaesthesia on somatosensory evoked potential measurement in a rat model. Laboratory Animals. 50 (1), 63-66 (2016).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neuroscience Letters. 483 (2), 127-131 (2010).
- Kuffler, S. W., Williams, E. M. V. Small-nerve junctional potentials. The distribution of small motor nerves to frog skeletal muscle, and the membrane characteristics of the fibres they innervate. The Journal of Physiology. 121 (2), 289-317 (1953).
- Brunton, E., Blau, C. W., Nazarpour, K. Separability of neural responses to standardised mechanical stimulation of limbs. Scientific Reports. 7 (1), 11138 (2017).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. The Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).
- Kagiava, A., Theophilidis, G. Assessing the permeability of the rat sciatic nerve epineural sheath against compounds with local anesthetic activity: an ex vivo electrophysiological study. Toxicology Mechanisms and Methods. 23 (8), 634-640 (2013).
- Motori, E., et al. Neuronal metabolic rewiring promotes resilience to neurodegeneration caused by mitochondrial dysfunction. Science Advances. 6 (35), 8271 (2020).
- Schwarz, J. R., Eikhof, G. Na currents and action potentials in rat myelinated nerve fibres at 20 and 37° C. Pflügers Archiv. 409 (6), 569-577 (1987).
- Cranefield, P. F., Brink, F., Bronk, D. W. The oxygen uptake of the peripheral nerve of the rat. Journal of Neurochemistry. 1 (3), 245-249 (1957).
- Lehmann, J. E. The effect of changes in pH on the action of mammalian A nerve fibers. American Journal of Physiology-Legacy Content. 118 (3), 600-612 (1937).
- Hamm, L. L., Nakhoul, N., Hering-Smith, K. S. Acid-base homeostasis. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 10 (12), 2232-2242 (2015).
- Minasian, S. M., Galagudza, M. M., Dmitriev, Y. V., Kurapeev, D. I., Vlasov, T. D. Myocardial protection against global ischemia with Krebs-Henseleit buffer-based cardioplegic solution. Journal of Cardiothoracic Surgery. 8, 60 (2013).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Miller, D. J. Sydney Ringer: physiological saline, calcium and the contraction of the heart. The Journal of Physiology. 555, 585-587 (2004).
- Yamamoto, D., Suzuki, N., Miledi, R. Blockage of chloride channels by HEPES buffer). Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 230 (1258), 93-100 (1987).
- Janz, G. J., Taniguchi, H. The silver-silver halide electrodes. Preparation, stability, and standard potentials in aqueous and non-aqueous media. Chemical Reviews. 53 (3), 397-437 (1953).
- Rapeaux, A., Constandinou, T. G. An HFAC block-capable and module-extendable 4-channel stimulator for acute neurophysiology. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046013 (2020).
- Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch. Next Generation Neural Interfaces Available from: https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch> (2021)
- Cuttaz, E. A., Chapman, C. A. R., Syed, O., Goding, J. A., Stretchable Green, R. A. fully polymeric electrode arrays for peripheral nerve stimulation. Advanced Science. 8 (8), 2004033 (2021).
- Lossi, L., Merighi, A. The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3Rs philosophy. Frontiers in Veterinary Science. 5, 164 (2018).
