Meervoudige intraveneuze bolusdosering en invasieve hemodynamische beoordeling in een door hypoxie geïnduceerd model voor hypertensie van de longslagader van muizen

Summary

Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure voor het uitvoeren van meervoudige intraveneuze toediening van bolusdoses en invasieve hemodynamische monitoring bij muizen. Onderzoekers kunnen dit protocol gebruiken voor toekomstige screening van therapeutische verbindingen voor hypertensie van de longslagader.

Abstract

Pulmonale arteriële hypertensie (PAH) is een progressieve levensbedreigende ziekte, die voornamelijk kleine longarteriolen van de long aantast. Momenteel is er geen remedie voor PAH. Het is belangrijk om nieuwe verbindingen te ontdekken die kunnen worden gebruikt om PAH te behandelen. Het door hypoxie geïnduceerde PAH-model bij muizen is een veelgebruikt model voor PAK-onderzoek. Dit model recapituleert menselijke klinische manifestaties van PAH Groep 3-ziekte en is een belangrijk onderzoeksinstrument om de effectiviteit van nieuwe experimentele therapieën voor PAH te evalueren. Onderzoek met behulp van dit model vereist vaak de toediening van verbindingen bij muizen. Voor een verbinding die rechtstreeks in de bloedbaan moet worden toegediend, is het optimaliseren van intraveneuze (IV) toediening een belangrijk onderdeel van de experimentele procedures. Idealiter zou het IV-injectiesysteem meerdere injecties gedurende een bepaalde tijdsverloop mogelijk moeten maken. Hoewel het door hypoxie geïnduceerde PAK-model bij muizen in veel laboratoria erg populair is, is het technisch een uitdaging om in dit model meerdere IV-bolusdoseringen en invasieve hemodynamische beoordeling uit te voeren. In dit protocol presenteren we stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van meerdere IV-bolusdoseringen via de halsader van de muis en het uitvoeren van arteriële en rechterventrikelkatheterisatie voor hemodynamische beoordeling in het door hypoxie geïnduceerde PAH-model van muizen.

Introduction

Hypertensie van de longslagader (PAH) wordt gedefinieerd door een gemiddelde systolische druk van de longslagader van meer dan 20 mmHg in rust ^1,2. Het is een progressieve en dodelijke ziekte die wordt gekenmerkt door een aanhoudende verhoging van de pulmonale arteriële druk, wat leidt tot overbelasting van de rechterventrikel en uiteindelijk tot de dood als gevolg van rechterventrikelfalen1. Momenteel is er geen remedie voor PAH.

Het gebruik van diermodellen van pulmonale hypertensie is belangrijk voor het testen van de effectiviteit van experimentele PAH-therapieën. Van die modellen heeft het door hypoxie geïnduceerde PAH-model bij muizen belangrijke inzichten opgeleverd in^{de ontwikkeling van} PAH-groep 3 bij de ^mens3,4. Onderzoek met dit model vereist vaak de toediening van verbindingen bij muizen om de effectiviteit en veiligheid van de nieuwe verbinding te evalueren. Daarom hebben onderzoekers een gedetailleerde experimentele procedure nodig voor het doseren van verbindingen en hemodynamische metingen om de consistentie van de injectie en de reproduceerbaarheid van de bloeddrukmeting van het begin tot het einde te garanderen.

Methoden voor intraveneuze (IV) injectie en bloeddrukmeting zijn in de literatuur beschreven ^5,6. De methodologie mist echter een visuele illustratie en gedetailleerde beschrijving. Hier illustreren we de belangrijkste stappen voor een succesvolle IV-bolusinjectie en nauwkeurige meting en registratie van systemische en rechterventrikelbloeddruk. De hier gepresenteerde procedures zijn een belangrijke bron voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de IV-route van het platform voor de toediening van verbindingen om een behandeling voor PAH te ontwikkelen.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens protocollen die waren goedgekeurd door Yale University Institutional Animal Care and Use Committees.

1. Voorbereiding van dieren, gereedschappen, bloeddrukmeetapparatuur en hypoxiekamer

1. Dierlijke acclimatisatie.
   OPMERKING: De proefdieren die voor dit onderzoek werden gebruikt, waren mannelijke, 8 weken oude C57BL/6-muizen met een gewicht van 25-27 g. Bij het schatten van het aantal dieren dat nodig is voor het experiment moet rekening worden gehouden met verschillende factoren, waaronder sterfte als gevolg van operaties, onverwachte chirurgische complicaties en plotseling onverwacht overlijden. Gebruik ten minste 10 muizen per groep om statistisch vermogen te bereiken en ondermaatse studies te vermijden.
   1. Huisvest de dieren bij ontvangst in geventileerde knaagdierkooien (groepen van vijf dieren per kooi) voorzien van geschikt strooisel, knaagdiervoer en water. Laat de dieren minimaal 3 dagen wennen aan de nieuwe omgeving (12 uur licht-donkercyclus bij 18-20 °C).
   2. Wijs ze willekeurig toe aan de volgende groepen: Normoxie (groep 1), hypoxie (groep 2) en hypoxie + 7C1/let-7 miRNA (groep 3).
2. Chirurgische instrumenten en voorbereiding van bloeddrukmeetapparatuur.
   1. Steriliseer alle chirurgische instrumenten door middel van autoclaveren (Figuur 1A).
   2. Bereid een geïmproviseerd injectieplatform voor met een zelfgemaakte anesthesieneuskegel (Figuur 1B), hechtdraadpakketten (Figuur 1C) en apparatuur voor de PAK-procedure (Figuur 1D-F).
3. Experimentele setting voor inductie van longslagaderhypertensie (PAH).
   1. Stel de N_2-tank , de zuurstofsensor en de semi-afsluitbare hypoxiekamer in (Figuur 2A).
   2. Stel een instelpunt van 10% O₂ in de zuurstofsensor in en laat het systeem de stationaire toestand bereiken (Figuur 2B, C).
   3. Houd hypoxie (groep 2) en hypoxie + 7C1/let-7 miRNA (groep 3) dieren in hypoxie (10% O₂) gedurende 3 weken. Na 3 weken hypoxie de dieren gedurende 1 week onder normoxische omstandigheden te plaatsen (figuur 2D). De normoxische groep (groep 1) blijft 4 weken in normoxie.
      OPMERKING: (1) 3 weken hypoxie gevolgd door 1 week normoxie is een gevestigde methode voor het ontwikkelen van PAH en hartfalen van de rechterventrikel⁷. De zuurstofsensor detecteert de_{O2-concentratie} in de semi-afsluitbare hypoxiekamer en corrigeert deze door_N2-gas via de gasinfuusbuis te injecteren.
   4. Inspecteer de dieren dagelijks gedurende de gehele duur van het experiment (3 weken). Raadpleeg een dierenarts als de dieren tekenen van angst vertonen, zoals dramatisch gewichtsverlies en ademhalingsmoeilijkheden. Als euthanasie nodig is voor de dieren in ernstige nood, sluit het dier dan uit van het onderzoek.
      OPMERKING: Blootstelling aan hypoxie veroorzaakt gewichtsverlies bij muizen. Een gewichtsverlies van 10% wordt meestal gebruikt als een betrouwbare indicatie van de ontwikkeling van PAK's.
   5. Vermijd het langdurig openen van de hypoxiekamer. Voor het schoonmaken van de kooi, het aanvullen van voedsel, het verwisselen van waterflessen en samengestelde toediening, opent u de kamers niet meer dan 1 uur per week.

2. Intraveneuze bolusinjectie via de halsader

1. Muisvoorbereiding en anesthesie.
   1. Haal hypoxie (groep 2) en hypoxie + 7C1/let-7 miRNA (groep 3) muizenkooien uit de hypoxiekamer en haal het dier voorzichtig uit de kooi.
      OPMERKING: Het doseringsschema voor 7C1/let-7 miRNA (1,5 mg/kg IV/dosis) is tweemaal per week gedurende 4 weken behandeling. Het wordt aanbevolen dat onderzoekers zowel hypoxie als hypoxie + samengestelde behandelingskooien uit de hypoxiekamer halen tijdens IV-injectie om ervoor te zorgen dat alle dieren dezelfde mate van blootstelling aan hypoxie per tijdsinterval krijgen.
   2. Weeg de muis met behulp van een precisieweegschaal en noteer het gewicht (Figuur 3A).
   3. Plaats de muis in een anesthesie-inductiekamer die is aangesloten op de anesthesieverdamper en sluit deze (Figuur 3B). Zorg voor thermische ondersteuning en breng oogsmeermiddel aan op beide ogen om uitdroging tijdens het verdoven te voorkomen. Stel de muis bloot aan 3% isofluraan totdat hij bewusteloos is (Figuur 3C-D).
   4. Haal de muis uit de kamer en scheer de vacht van de kaak craniaal tot het midden van het borstbeen caudaal. Scheer de vacht zijdelings vanuit de kaakhoeken, langs de zijkanten van de nek en in de richting van de schouders (Figuur 3E).
   5. Plaats de met isofluraan verdoofde muis in rugligging (buikzijde naar boven) op een injectieplatform onder een dissectiemicroscoop. Handhaaf de anesthesie via een neuskegel met 1,5% isofluraan en zet de vier poten voorzichtig vast met plakband om het lichaam te immobiliseren (Figuur 3F).
   6. Breng een schadelijke stimulus aan (d.w.z. teenknijpen) met een rechte pincet om een adequaat niveau van anesthesie te garanderen. De verdoofde muis mag niet reageren op de stimulatie voorafgaand aan en tijdens de chirurgische ingreep.
2. Bereiding van het injectiemiddel.
   1. Bereid een injectiemiddel voor eenmalig gebruik in een dosis van 1,5 mg/kg onder steriele omstandigheden.
      OPMERKING: Verwarm de injectiemassa tot kamertemperatuur (RT), aangezien injectie van koude stoffen ongemak en een daling van de lichaamstemperatuur van de muis kan veroorzaken (als dit de verbinding niet beschadigt). De optimale dosis en duur van verbinding 7C1/let-7 miRNA die in deze studie wordt gebruikt, zijn gebaseerd op eerdere publicaties ^8,9.
   2. Vul de steriele spuit voor eenmalig gebruik met het volume dat moet worden geïnjecteerd. Houd de spuit rechtop en schuif de zuiger naar voren om de lucht uit de spuit te verdrijven. Gebruik de spuit niet opnieuw.
   3. Beperk het injectievolume tot 200 μl in een muis van 25 g om de incidentie van hemodilutie en abnormale cardiale effecten op de dieren te verminderen. Als een groter volume nodig is, verdeel het injectiemiddel dan in twee injecties met een interval van 10 minuten.
3. Bereid de muis voor op een IV-injectie.
   1. Schrob het operatiegebied drie keer voorzichtig met drie afwisselende rondes povidon-jodiumoplossing en 70% ethanol. Dien buprenorfine (0,05 mg/kg, SQ) 30 minuten voorafgaand aan de chirurgische ingreep toe.
   2. Maak met een scalpelmesje een lengtesnede van 0,5 cm iets rechts van de middellijn van de nek (Figuur 3G).
   3. Gebruik een pincet om de spier en het vetweefsel te scheiden om de rechter uitwendige halsader te lokaliseren (Figuur 3H).
      OPMERKING: Wissel de injectieplaatsen elke keer af om littekenvorming te voorkomen.
   4. Gebruik een objectief met hoog vermogen om het injectiegebied gemakkelijk te visualiseren (Figuur 3I).
4. IV-injectie
   1. Steek een steriele naald van 28 G in de halsader met de afschuining van de naald naar boven gericht (Figuur 3J, K).
      OPMERKING: Injectie van staartaders is een alternatief voor injectie van halsaders. Deze techniek is echter moeilijk uit te voeren bij herhaalde dosering vanwege de variabiliteit in aderdiepte, huidskleur van de staart van muizen en huidhardheid.
   2. Druk langzaam op de zuiger van de spuit om de verbinding in de ader te injecteren. Laat de naald nog 10 seconden in de ader blijven om terugstroming van het injecteermiddel te voorkomen (Figuur 3L).
      OPMERKING: De blauwachtige kleurstof zorgt voor een gemakkelijke visualisatie van de injectie. Voeg de kleurstof niet toe bij het injecteren van testmaterialen. Een onnauwkeurige injectie zal resulteren in de ophoping van blauwachtige kleurstof rond de IV-injectieplaats.
   3. Verwijder de naald en gebruik een wattenstaafje om druk uit te oefenen op de injectieplaats om bloedingen te voorkomen (Figuur 3M).
   4. Hecht de huid met 5-0 hechting (Figuur 3N). Verplaats het dier na de operatie naar een warme, schone, droge ruimte en geef Meloxicam (1 mg/kg, SQ, elke 24 uur). Plaats het dier in een schone herstelkooi zonder bodembedekking, maar met de bodem bedekt met keukenpapier.
      NOTITIE: De muis moet wakker zijn uit de anesthesie en binnen 5 minuten weer bij bewustzijn komen zodra hij terug is in de herstelkooi. Houd de muis in de gaten op tekenen van nood.
   5. Breng de dieren terug naar hun thuiskooi en plaats de muizenkooi terug in de hypoxiekamer.
      OPMERKING: De hele procedure, van het verdoven van een muis tot het beëindigen van de halsaderinjectie, duurt ongeveer 10-15 minuten door een enkele experimentator. Om de blootstelling aan normoxie bij muizen te verkorten, wordt aanbevolen dat ten minste twee onderzoekers samenwerken om een halsaderinjectieprocedure uit te voeren.

3. Bloeddrukmeting

1. Bereid instrumenten voor op het meten van de bloeddruk.
   1. Week de punt van de katheter van 1.0 F in een voorverwarmde PBS van 37 °C ten minste 30 minuten vóór de hemodynamische meting (Figuur 4A).
   2. Meet de afstand van de plaats waar de katheter wordt ingebracht tot de gewenste locatie van de kathetertip. De afstand tussen de aorta van de muis en het midden van de nek is bijvoorbeeld ongeveer 1-1,2 cm. De afstand tussen de rechterhartkamer en het midden van de nek is ongeveer 2,3-2,8 cm.
   3. Markeer twee afstandsmarkeringen van de katheter om een visuele indicatie te geven van de inbrengdiepte (Figuur 4B).
   4. Bevestig de katheter aan de druktransducer, sluit de druktransducer aan op ingangskanaal 1 op het data-acquisitieapparaat, schakel de druk-volumeregeleenheid in en start data-acquisitie bloeddrukanalysesoftware. Maak een nieuw bloeddrukanalysedocument en stel kanaal 1 in voor druk.
   5. Voer een drukkalibratie uit volgens het protocol van de fabrikant. Laat de hele opstelling minimaal 5 minuten stabiliseren (Figuur 4C).
   6. Selecteer in bloeddrukanalysesoftware Eenhedenconversie in het vervolgkeuzemenu Kanaal 1 (Afbeelding 4D, rode pijl).
   7. Stel de standaard conversiewaarden voor eenheden in (Afbeelding 4E).
      OPMERKING: De bloeddruk wordt weergegeven als millimeters kwik (mmHg). De gestandaardiseerde drukoutput van de drukregeleenheid is 1 V per 100 mmHg. 25 mmHg komt overeen met 0,25 V uitgang en 100 mm Hg komt overeen met 1 V uitgang.
2. Bereid de muis voor op de bloeddrukmetingsprocedure.
   1. Verdoof de muis met 3% isofluraan inhalatie via een neuskegel.
   2. Breng de veterinaire zalf rechtstreeks op het oogoppervlak van de muizenogen aan om uitdroging te voorkomen, omdat de muis zijn ogen niet kan sluiten onder narcose. Scheer de vacht van de nek van de muis terwijl u onder narcose bent.
   3. Schrob het geschoren gebied met drie afwisselende rondes povidon-jodiumoplossing en 70% ethanolwattenstaafje. Plaats de verdoofde muis in rugligging op een injectieplatform onder een dissectiemicroscoop. Plaats de neus van de muis in de neuskegel om de anesthesie (1,5% isofluraan) tijdens de chirurgische ingreep te behouden.
   4. Test de motorische reactie van de verdoofde muis op de schadelijke stimulus. De verdoofde muis mag voor en tijdens de operatie niet reageren op een schadelijke stimulus.
      OPMERKING: Inhaleerbare (isofluraan) en injecteerbare (ketamine/xylazine) anesthetica kunnen de bloeddruk verlagen. Over het algemeen heeft isofluraan-inhalatie-anesthesie een gering effect op het verlagen van de bloeddruk dan ketamine/xylazine. Daarom heeft isofluraan de voorkeur boven ketamine/xylazine. Het bereiken van de juiste diepte van anesthesie is van cruciaal belang voor nauwkeurige en reproduceerbare hemodynamische metingen. De onderzoeker moet de diepte van de anesthesie voor elke muis constant houden.
3. Oplopende aortakatheterisatie
   1. Breng een schadelijke stimulus aan (d.w.z. teenknijpen) met een rechte pincet om een adequaat niveau van anesthesie te garanderen. Maak een incisie in de middellijn van de huid van de onderkaak tot het borstbeen (figuur 5A).
   2. Scheid de speekselklieren en leg de luchtpijp bloot (Figuur 5B).
   3. Gebruik een pincet om het zachte weefsel langs de bloedvaten vrij te maken om de rechter halsslagader en de rechter externe halsader bloot te leggen (Figuur 5C).
   4. Doe 0,5 ml PBS in de holte om de ontwikkeling van vasospasme te vertragen terwijl de halsslagader wordt gemanipuleerd.
   5. Isoleer zorgvuldig een stuk van 5 mm van de rechter halsslagader. Leg een stuk steriel wit papier onder het vat als achtergrond om de slagader beter zichtbaar te maken (Figuur 5D).
      OPMERKING: Scheid de nervus vagus (wit) zorgvuldig van de slagader en zorg ervoor dat u de zenuw of de slagader niet doorsnijdt of beschadigt.
   6. Met behulp van een 8-0 hechtdraad leg een permanente knoop om het craniale uiteinde van het vat af te sluiten (Figuur 5E).
   7. Leg een eerste losse knoop om de bloedstroom uit de aorta tijdelijk af te sluiten. Leg vervolgens een tweede losse knoop tussen de eerste twee hechtingen (Figuur 5F). De tweede losse knoop wordt gebruikt om de katheter na plaatsing snel vast te zetten.
   8. Maak met een naald van 25 G een klein gaatje, groot genoeg om de katheter te passeren, in lijn met het bloedvat tussen de ligaturen #3 en #1 (Figuur 5G).
      OPMERKING: Halsslagaders vervoeren zuurstofrijk bloed uit het hart en hebben een zeer hoge druk. Als de halsslagader wordt doorgesneden, zal die druk ervoor zorgen dat het bloed naar buiten spuit (Figuur 5H).
   9. Houd de katheter 1.5 inch van de punt en steek de punt van de katheter voorzichtig door het gat van de slagader (X-markering). Draai de middelste hechtknoop vast rond de katheter en het bloedvat dat de katheter nog doorlaat (Figuur 5I-J).
      OPMERKING: Deze stap vereist oefening. De mogelijke complicaties bij deze stap zijn onder meer bloedingen op de inbrengplaats van de katheter en vasospasme. Wanneer er een bloeding optreedt, vermindert bloedverlies uit de bloedslagader het bloedvolume, wat leidt tot een ernstige daling van de systemische bloeddruk. Vanwege de ernst heeft het dier een humaan eindpunt bereikt en moet het worden geëuthanaseerd. Voor mechanisch geïnduceerd vasospasme treedt het meestal op tijdens het inbrengen van de katheter veroorzaakt door een aanhoudende samentrekking van de bloedvaten. Dit maakt de opening van het bloedvat kleiner en voorkomt dat de katheter naar de halsslagader gaat. Gebruik geen overmatige kracht tegen weerstand om de katheter vooruit te duwen. Wanneer matige of ernstige vasospasmeresistentie wordt aangetroffen, probeer het dan over een tijdje opnieuw of gebruik een kleinere katheter (bijv. 1.0 F). Ervaren microchirurgen kunnen 100% slagingspercentages behalen voor oplopende aortakatheterisatie.
   10. Nadat de katheter de eerste losse knoop met de sensorpunt heeft gepasseerd, maakt u de tweede losse knoop steviger vast om de katheter vast te zetten en laat u de eerste losse knoop voorzichtig los (Figuur 5K, L).
   11. Blijf de katheter in de richting van de aorta ascendens inbrengen volgens de markering op de katheter (Figuur 4B) totdat de drukanalyse een arteriële bloeddrukprofiel laat zien (Figuur 5M). Registreer systemische bloeddrukgegevens (SBP) met behulp van het data-acquisitiesysteem en de software.
   12. Maak de middelste hechtknoop los zodat de katheter eruit kan worden getrokken (Figuur 5N).
   13. Bind de middelste hechtknoop rond het bloedvat voordat u de katheter uit de halsslagader trekt (Figuur 5O-P).
   14. Plaats de katheter in PBS.
4. Katheterisatie van het rechterhart.
   1. Isoleer zorgvuldig de rechter uitwendige halsader van het omringende bindweefsel en ligate alle kleine vertakkingen met 8-0 hechting (blauwe pijlpunten) (figuur 6A).
      OPMERKING: Voor katheterisatie van het rechterhart wordt het hart gewoonlijk benaderd via de rechter halsader.
   2. Met behulp van een 8-0 hechtdraad, leg een permanente knoop om het craniale uiteinde van het vat af te sluiten (Figuur 6B). Leg vervolgens een losse knoop aan het staartuiteinde van het vat (Figuur 6C).
   3. Gebruik een naald van 25 G om een klein gaatje te maken in de buurt van de permanente knoop (Figuur 6D).
      OPMERKING: Halsaders transporteren zuurstofarm bloed naar het hart en hebben een lage druk. Als de halsader wordt doorgesneden, zal het bloed niet naar buiten spuiten (Figuur 6D, E).
   4. Houd de katheter vast en steek de katheter in de snede van de ader (X-markering) (Figuur 6E) en trek de caudale knoop rond de katheter en het bloedvat aan (Figuur 6F).
   5. Duw de katheter langzaam en voorzichtig in het rechterhart. Controleer de diepte van de kathetertip op basis van de kathetermarkering (Figuur 4B).
      OPMERKING: Beoordeling van de systolische druk van de rechterventrikel (RVSP) bij muizen met gesloten borstkas is een uitdaging vanwege de complexe RV-anatomie en -structuur. Deze stap vereist een hoog niveau van expertise en veel oefening. In de handen van een ervaren microchirurg kan het slagingspercentage voor katheterisatie van de rechterventrikel 90% benaderen.
   6. Beoordeel de positie van de kathetertip aan de hand van de drukgolftracering in de software. Wanneer de punt van de katheter zich in de rechterhartkamer bevindt, toont de monitor een typische RVSP-tracering (Figuur 6G, H).
      OPMERKING: Wanneer de vorm van longdrukcurven er atypisch uitziet (bijv. stekelige curves), impliceert dit een onjuiste positionering van de katheter. Pas de positie van de katheter aan door de katheter voorzichtig een beetje naar achteren te trekken en de katheter vervolgens langzaam naar een meer centrale positie in de rechterhartkamer te brengen. Om het genereren van artefacten in onderzoeksgegevens te voorkomen, moet de onderzoeker langdurige (niet meer dan 1 minuut) of herhaalde pogingen (niet meer dan twee pogingen) tot katheterisatie van de rechterventrikel vermijden.
   7. Houd de katheter onbeweeglijk en verzamel de gegevens gedurende 5 minuten.
   8. Nadat de opname is voltooid, trekt u de katheter er voorzichtig uit en legt u de caudale knoop rond het vat (Figuur 6I). Plaats de katheter terug in de PBS-oplossing.
      NOTITIE: Reinig de katheter na voltooiing van het experiment met 1% spijsverteringsenzymoplossing volgens de instructies van de fabrikant. Naast het beoordelen van de hemodynamische status, kunnen onderzoekers de harten en de longen oogsten voor histopathologisch onderzoek van PAH. Om de effectiviteit van meervoudige IV-bolusdosering te garanderen, kunnen onderzoekers longendotheelcellen isoleren en let-7 miRNA-niveaus meten.

4. Analyse van bloeddrukgegevens

1. Bestudeer de bloeddrukregistratie.
   1. Open het gegevensbestand van de bloeddrukanalysesoftware (PAH JOVE.adicht).
   2. Selecteer in kanaal 1 een gebied dat het druksignaal vertegenwoordigt en plaats de golfvormcursor op de piek (X-markering) om de drukamplitude te meten (Figuur 7A).
   3. Bepaal de maximale amplitude van de drukgolf. Dit geeft de systolische druk weer (Figuur 7A, rode pijl).
   4. Extraheer het interessegebied (Figuur 7B grijs gebied) uit de afbeelding door op Shift + Command + 3 (voor Mac) of Windows + Shift + S (voor Windows-pc) te drukken en plak het in een grafisch bestand.
2. Statistische analyse van bloeddrukgegevens.
   1. Voer de bloeddrukgegevens van de individuele muis in statistische analysesoftware in.
   2. Voer een ongepaarde t-toets van de student uit voor statistische analyse van twee studiegroepen (normoxie vs. hypoxie; hypoxie vs. hypoxie + 7C1/let-7 miRNA). Beschouw de verschillen in gemiddelde waarden als zo significant als p < 0,05.

Representative Results

Anesthesie verlaagt vaak de bloeddruk. Daarom werd een minimale dosis anesthesie gebruikt om de bewegingen als reactie op een schadelijke stimulus af te schaffen. Succesvolle toegang tot de rechterventrikelkamer kan worden gevisualiseerd als de hemodynamische golfvorm verandert in verschillende regio's van veneuze systemen (Figuur 8).

In deze studie werden muizen willekeurig toegewezen aan de normoxische (21% O₂) groep (n = 10), hypoxie (10% O₂) groep (n = 10) of hypoxie + 7C1/let-7 behandelingsgroep (n = 10). Om het effect van let-7 miRNA op de onderdrukking van hypoxie-geïnduceerde PAH-ontwikkeling te onderzoeken, werd geformuleerd 7C1/let-7 miRNA intraveneus toegediend aan de C57BL/6-muizen in een dosis van 1,5 mg/kg tweemaal per week gedurende 4 weken (Figuur 2D).

4 weken na blootstelling aan hypoxie of normoxie werden SBP en RVSP gemeten in een muis met gesloten borstkas. Figuur 9A toont de representatieve bloeddrukcurve van de normoxische, hypoxie- of hypoxie- + 7C1/let-7 miRNA-behandelingsgroepen. Vergeleken met die in de normoxie-controlegroep was RVSP significant verhoogd in de hypoxiegroep. Bovendien resulteerde behandeling met 7C1/let-7 miRNA-verbinding bij muizen in vergelijking met de hypoxiegroep in een significant verlaagde RVSP (Figuur 9B). SBP veranderde in geen enkele groep, wat in overeenstemming is met de vorige rapporten⁷. 7C1/let-7 miRNA richt zich op endotheelcellen en verlaagt de TGFβ-signaleringscascade⁸. De gegevens tonen aan dat 7C1/let-7 miRNA 1,5 mg/kg zeer effectief is in het verlagen van de bloeddruk in de rechterhartkamer, wat de effectiviteit van de meervoudige intraveneuze bolusdosering aantoont.

Figuur 1: Chirurgische instrumenten en bloeddrukmeetapparatuur die nodig zijn voor procedures voor hypertensie van de longslagader. (A) Chirurgische instrumenten die worden gebruikt voor PAK-procedures. (B) Een geïmproviseerd injectieplatform gemaakt van een absorberend kussen dat om een piepschuimrek is gewikkeld uit een conische verpakking van 50 ml. Bevestiging van een anesthesiebuisje van 10 cm lengte aan het injectieplatform als neuskegel met type. (C) Hecht pakkingen. 5-0 hechting voor incisiesluiting en 8-0 hechting voor ligatie. (D-F) Apparatuur voor het meten van de bloeddruk die wordt gebruikt voor de PAK-procedure. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Experimentele setting voor PAK-inductie. (A) Foto van het opzetten van het hypoxische systeem BioSpherix. Verschillende onderdelen van het inductiesysteem worden aangegeven. (B-C) Zuurstofsensor die de O_{2-concentratie} van de hypoxiekamer bewaakt. (D) Experimentele tijdlijn voor behandeling met 7C1/let-7 miRNA-verbindingen en blootstelling aan zuurstofniveaus voor alle diergroepen tijdens PAK-inductie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Foto's van de belangrijkste chirurgische stappen voor de injectie van de halsader. (A) Muis op een weegschaal. (B) Installatie van het inductiesysteem voor anesthesie bij knaagdieren. Verschillende onderdelen van het inductiesysteem worden aangegeven. (C-D) Foto's van een met isofluraan verdoofde muis in een inductiekamer. (E) Bont verwijderd chirurgische zone. (F) Een muis werd op een injectieplatform geplaatst en ademde 1,5% isofluraan in door een neuskegel uit een verdamper. (G) Huidincisie voor benadering van de halsader. (H) Chirurgische dissectie van de rechter uitwendige halsader. (I) Beeldvorming met een hogere vergroting die de geïsoleerde rechter halsader laat zien. Let op een wit papier onder het vat, waardoor de ader beter zichtbaar wordt. (J-K) Rechter halsadernaald inbrengen met de afschuining omhoog. (L) Injectie van een verbinding met blauwachtige kleurstof in de halsader. (M) Druk uitoefenen op de injectieplaats met behulp van een wattenstaafje na het terugtrekken van de naald. (N) Het hechten van de wond met een 5-0 hechting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Katheterkalibratie. (A) Weken van de kathetertip van 1,0 F in voorverwarmde PBS van 37 °C. (B) Afstandsmarkeringen op de katheter om de diepte van het inbrengen van de katheter in de aorta ascendens en de rechterhartkamer te helpen schatten. (C) Bloeddrukmeetapparatuur die een nulbasiskalibratie ondergaat. (Ca') Screenshot van bloeddrukanalyse op basis van software voor de basislijnanalyse van de katheter. (D) Selecteer in het vervolgkeuzemenu Kanaal 1 het dialoogvenster Eenhedenconversie in de bloeddrukanalysesoftware. (E) Instellen van de standaard eenheden Conversiewaarden om het ingangsspanningssignaal om te zetten naar een mmHg-eenheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Chirurgische ingrepen voor systemische bloeddrukmetingen (SBP). (A) Een incisie in de middellijn van de onderkaak naar het borstbeen op de huid van de nek. (B) Scheiding van de speekselklier om de luchtpijp bloot te leggen. (C) Blootgestelde rechter halsslagader en rechter uitwendige halsader na weefseldissectie. (D) Een geïsoleerd stuk van 5 mm van de halsslagader. (E,F) Hecht permanente knoop aan het craniale uiteinde en twee losse knopen aan het caudale uiteinde. (G,H) Het maken van een klein gaatje (X-teken) in de halsslagader net caudaal van de permanente knoop . (I) Inbrengen van de katheter in de halsslagader. (J) Vastzetten van de katheter met een middelste hechtdraad . (K,L) Maak voorzichtig de eerste losse knoop los . (M) Representatieve arteriële drukgolven. (N) Losmaken van de middelste hechtdraad . (O,P) Aanspannen van de middelste hechtdraad rond het vat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Chirurgische ingrepen voor metingen van de systolische druk (RVSP) van de rechterventrikel. (A) Ligatie van de kleine vertakkingen van de rechter halsader (blauwe pijlpunten). (B) Een permanente knoop aan het craniale uiteinde van de halsader. (C) Een losse knoop aan het staartuiteinde van de halsader. (D) Maak een klein gaatje in de rechter halsader caudaal naar de permanente knoop . (E) Inbrengen van een katheter in de halsader door een klein gaatje (X-markering). (F) Het aanspannen van de caudale knoop rond de katheter en het bloedvat. (G) De katheter in de rechterhartkamer duwen. (H) Vertegenwoordiger RVSP. (I) Aanspannen van de caudale knoop rond het vat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Analyse van de gegevens van de bloeddrukanalysesoftware na opname. (A) De golfvormcursor gebruiken om de drukamplitude te meten op basis van de onbewerkte gegevens van de bloeddrukanalysesoftware in kanaal 1. (B) Het extraheren van het interessegebied uit de ruwe afbeelding van de bloeddrukanalysesoftware. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Hemodynamische golfvormovergang tijdens katheterisatie van de rechterventrikel. (A-D) Representatieve sporen van drukveranderingen tijdens de rechterventrikelkatherisatie van een C57BL/6-muis bij muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Bloeddrukanalyse, representatiecijfers en data-analyse. (A) Representatieve SBP- en RVSP-curven bij met normoxie, hypoxie en hypoxie + 7C1/let-7 miRNA behandelde muizen. (B) Samenvattende plots van SBP en RVSP in met normoxie, hypoxie en hypoxie + 7C1/let-7 miRNA behandelde muizen (NS: niet significant; **p < 0,01; ***p < 0,001; ongepaarde tweezijdige Student's t-toets). N = 10 per groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Er zijn verschillende diermodellen voor pulmonale hypertensie opgesteld om de verhoogde pulmonale vasculaire weerstandsgebeurtenissen bij menselijke proefpersonen na te bootsen. Onder hen is het door hypoxie geïnduceerde PAH-model van muizen op grote schaal gebruikt voor het evalueren van de effectiviteit van nieuwe experimentele therapieën voor PAH. Onderzoek met behulp van dit model vereist vaak de toediening van verbindingen aan de muizen. In vergelijking met andere gepubliceerde intraveneuze (IV) injectie en invasieve hemodynamische beoordelingsprotocollen, biedt deze methode zowel visuele illustratie als gedetailleerde beschrijving.

Er zijn drie cruciale stappen voor de succesvolle uitvoering van de procedure en voor het verkrijgen van nauwkeurige en reproduceerbare bloeddrukmetingen. Zorg er eerst voor dat de naald van de spuit correct in de halsader is geplaatst. Onjuiste injectie van de halsader kan leiden tot subcutane injectie. Ten tweede, zorg voor voldoende diepte van de anesthesie. Consistente anesthesiediepte in elke muis is belangrijk voor het genereren van gegevens die vergelijkbaar zijn tussen groepen. Een te diepe anesthesie kan een aanzienlijke verlaging van de bloeddruk veroorzaken. Naast isofluraan-inhalatie-anesthesie is intraperitoneale injectie van ketamine/xylazine een andere veelgebruikte anesthesiemethode voor muizenchirurgie. Beide methoden hebben voor- en nadelen. De isofluraan-inhalatie-anesthesie heeft verschillende voordelen ten opzichte van injecteerbare ketamine/xylazine, waaronder een snel begin, geen gecontroleerde medicijnen, snel herstel en het is veel gemakkelijker om de diepte van de anesthesie te regelen. De nadelen zijn de kosten van de apparatuur, onaangename geur en menselijke blootstelling aan verdovingsgassen. Ten derde, zorg ervoor dat de katheter zich in de rechterhartkamer bevindt. Langdurige of meerdere mislukte pogingen tot katheterisatie van de rechterventrikel kunnen valse bloeddrukmetingen veroorzaken.

IV-injectie bij muizen wordt voornamelijk toegediend via de laterale staartaders. Hoewel deze route gemakkelijk te bereiken is met naalden, is het bij deze techniek soms moeilijk om meerdere IV-bolusdoseringen uit te voeren. De twee grootste uitdagingen bij het uitvoeren van deze techniek zijn de variabiliteit in aderdiepte en de moeilijkheid van naaldvisualisatie als gevolg van de staart, huidskleur en huidhardheid van muizen. Wat nog belangrijker is, er is geen manier om te bevestigen of de volledige inhoud van de injectie met succes in de bloedbaan is terechtgekomen en niet in de omliggende weefsels. De halsader is een voorkeurstoegangsplaats omdat (1) het klinisch relevant is, (2) het visuele bevestiging geeft van de toediening van injectaat aan de ader, (3) het meerdere injecties van een groep dieren in de loop van het experiment mogelijk maakt, en (4) deze injectietechniek veilig is en de procedure geen bijwerkingen veroorzaakt.

Er zijn drie manieren om de bloeddruk bij muizen te registreren: (1) Niet-invasieve tail-cuff plethysmografie¹⁰. De systemen maken herhaalde metingen mogelijk in de loop van een longitudinale studie. (2) Radiotelemetrie¹¹. De systemen maken het mogelijk om de bloeddruk in levende en vrij bewegende proefdieren in real time te monitoren. (3) Invasieve intra-arteriële katheters¹². De systemen maken acute SBP- en RVSP-metingen mogelijk. In dit protocol hebben we gekozen voor een drukkatheter voor high-fidelity systemische en rechterventrikeldrukmetingen. Deze methode heeft echter enkele beperkingen. Ten eerste zijn de drukkatheter en bloeddrukmeetapparatuur duur (Figuur 1E-F). Ten tweede vereist het verdoven van de dieren, dit veroorzaakt een verlaging van de bloeddruk. Ten derde is rechterhartkatheterisatie een terminale procedure die geen seriële metingen mogelijk maakt. Ten vierde is de procedure niet gemakkelijk te leren, zelfs niet door een goed opgeleide microchirurg.

Zodra de bloeddruk is geregistreerd, kan de onderzoeker de harten en longen van de dieren isoleren voor histologische PAK-karakterisering. Bijvoorbeeld metingen van de dikte van de rechterventrikelwand voor hypertrofie van de rechterventrikel en analyse van gespierde pulmonale distale vaten voor remodellering van de longslagader van de spier. De gegevens tonen aan dat 7C1/let-7 miRNA zeer effectief is in het verlagen van de pulmonale bloeddruk, wat de effectiviteit van onze meervoudige IV-bolusdosering aantoont. Bovendien kunnen onderzoekers longendotheelcellen isoleren uit de vers geïsoleerde hele long om de effectiviteit van geïnjecteerde materialen te evalueren.

Samengevat biedt dit protocol een stapsgewijze procedure voor het uitvoeren van meervoudige IV-bolusdosering en invasieve hemodynamische monitoring in een door hypoxie geïnduceerd PAH-model bij muizen. Onderzoekers kunnen halsaderinjectie en arteriële/rechterventrikelkatheterisatietechnieken gebruiken die hier worden beschreven voor een breed scala aan knaagdiermodellen die IV-injectie en hemodynamische monitoring vereisen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 prolene suture pack	Ethicon	8698G	for incision closure
8-0 nylon suture pack	AROSurgical Instruments	T06A08N14-13	for ligation
Anesthesia induction chamber	VETEQUIP	#941444	Holds the animal during anesthesia exposure
Catheter Interface Cable PEC-4D	Millar		for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PCU-2000
Charcoal canister filters	VETEQUIP	#931401	to help remove waste anesthetic gases
Cotton swabs	McKesson	24-106	for applying pressure to the injection site to prevent bleeding
Fine scissors	Fine Science Tools	14059-11	Surgical tools
Insulin syringe 28 G	EXEL	26027	for jugular vein IV injection
Isoflurane	COVETRUS	#029405	for mouse anesthesia
LabChart 8 Software	ADInstruments		for data analysis
Mikro-Tip Pressure Catheter SPR-1000 (1.0 F)	Millar		for invasive blood pressure measurement
Needle-25 G	BD	305124	for making a samll hole in a vessel
Oxygen controller ProOx Oxygen Sensor	BioSpherix	E702	for oxygen concentration monitoring
PCU-2000 Pressure Control Unit	Millar		for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PowerLab 4/35
PowerLab 4/35	ADInstruments		for Data Acquisition. Investigator needs to connect the PowerLab 4/35 to a personal laptop containing LabChart 8 software for operation.
Prism 8	GraphPad		for statistics and scientific graphing
Semisealable hypoxia chamber	BioSpherix		an artificial environment that simulates high-altitude conditions for animals
Spring Scissors	Fine Science Tools	15021-15	Surgical tools
Tweezer Style 4	Electron Microscopy Sciences	0302-4-PO	Surgical tools
VasoRx compound 7C1/let-7 miRNA	VasoRx, Inc.	Lot# B2-L-16Apr	IV injection compound
VIP 3000 Veterinary Vaporizer	COLONIAL MEDICAL SUPPLY CO., INC.		for accurate anesthesia delivery