Técnicas moleculares e inmunológicas en un modelo de ratón genéticamente modificado de tumor del estroma gastrointestinal
Summary
El objetivo de este manuscrito es describir el modelo de ratón KitV558Δ/+ y las técnicas para la disección y el procesamiento exitosos de especímenes de ratón.
Abstract
El tumor del estroma gastrointestinal (GIST) es el sarcoma humano más común y generalmente es impulsado por una sola mutación en el receptor KIT. En todos los tipos de tumores, se han desarrollado numerosos modelos de ratón para investigar la próxima generación de terapias contra el cáncer. Sin embargo, en GIST, la mayoría de los estudios in vivo utilizan modelos de ratón de xenoinjerto que tienen limitaciones inherentes. Aquí, describimos un modelo de ratón inmunocompetente y genéticamente modificado de tumor del estroma gastrointestinal que alberga una mutación KitV558Δ / + . En este modelo, el KIT mutante, el oncogén responsable de la mayoría de los GIST, es impulsado por su promotor endógeno que conduce a un GIST que imita la apariencia histológica y el infiltrado inmune visto en los GIST humanos. Además, este modelo se ha utilizado con éxito para investigar tanto terapias moleculares como inmunes dirigidas. Aquí, describimos la cría y el mantenimiento de una colonia de ratones KitV558Δ / + . Además, este documento detalla el tratamiento y la obtención de GIST, el drenaje del ganglio linfático mesentérico y el ciego adyacente en ratones KitV558Δ / + , así como la preparación de muestras para análisis moleculares e inmunológicos.
Introduction
GIST es el sarcoma más común en humanos con una incidencia de aproximadamente 6.000 casos en los Estados Unidos de América1. El GIST parece originarse en las células marcapasos gastrointestinales llamadas células intersticiales de Cajal, y generalmente es impulsado por una sola mutación en la tirosina quinasa KIT o PDGFRA2. La cirugía es el pilar del tratamiento para el GIST y puede ser curativa, pero los pacientes con enfermedad avanzada pueden ser tratados con el inhibidor de la tirosina cinasa (TKI), imatinib. Desde su introducción hace más de 20 años, imatinib ha transformado el paradigma de tratamiento en GIST, mejorando la supervivencia en enfermedad avanzada de 1 a más de 5 años 3,4,5. Desafortunadamente, imatinib rara vez es curativo debido a mutaciones KIT adquiridas, por lo que se necesitan nuevos tratamientos para este tumor.
Los modelos de ratón son una importante herramienta de investigación en la investigación de nuevas terapias en cáncer. Se han desarrollado e investigado múltiples modelos de xenoinjerto subcutáneo y xenoinjerto derivado del paciente en GIST 6,7. Sin embargo, los ratones inmunodeficientes no representan completamente el GIST humano, ya que los GIST albergan perfiles inmunes diferenciales dependiendo de su mutación oncogénica, y la alteración del microambiente tumoral gastrointestinal mejora los efectos de la terapia TKI 8,9. El ratón KitV558Δ/+ tiene una deleción heterocigota de la línea germinal en el exón Kit 11, que codifica el dominio yuxtamembrana, el sitio más comúnmente mutado en GIST10 humano. Los ratones KitV558Δ/+ desarrollan un GIST cecal único con penetrancia del 100%, y los tumores tienen histología, señalización molecular, infiltración inmune y respuesta a la terapia similares a GISThumanos 8,11,12,13. Aquí, describimos la cría, el tratamiento y el aislamiento y procesamiento de muestras en ratones KitV558Δ / + para su uso en investigación molecular e inmunológica en GIST.
Protocol
Representative Results
Discussion
El modelo de ratón KitV558Δ/+ es una poderosa herramienta de investigación en el análisis molecular e inmunológico de GIST. Aunque la estrategia de mejoramiento requiere un solo cruce, el uso de cohortes de ratones KitV558Δ / + en experimentos que analizan la respuesta tumoral requiere una reproducción extensa. Los ratones deben ser emparejados por edad y sexo para garantizar pesos tumorales similares, y el 10% de los ratones mueren antes de las 8 semanas de edad cuando se e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los ratones KitV558Δ/+ fueron modificados genéticamente y compartidos por el Dr. Peter Besmer10. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH R01 CA102613 y T32 CA251063.
Materials
| 100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| 3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
| 4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| 70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
| AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
| Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
| HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
| KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
| Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
| Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
| p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
| p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
| PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
| Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| vivaCT 80 platform | Scanco medical |
Riferimenti
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