Techniques moléculaires et immunologiques dans un modèle murin génétiquement modifié de tumeur stromale gastro-intestinale
Summary
L’objectif de ce manuscrit est de décrire le modèle de souris KitV558Δ/+ et les techniques de dissection et de traitement réussis des spécimens de souris.
Abstract
La tumeur stromale gastro-intestinale (GIST) est le sarcome humain le plus courant et est généralement entraînée par une seule mutation du récepteur KIT. Parmi les types de tumeurs, de nombreux modèles murins ont été développés afin d’étudier la prochaine génération de thérapies contre le cancer. Cependant, dans GIST, la plupart des études in vivo utilisent des modèles murins de xénogreffe qui ont des limites inhérentes. Ici, nous décrivons un modèle murin immunocompétent et génétiquement modifié de tumeur stromale gastro-intestinale hébergeant une mutation KitV558Δ / +. Dans ce modèle, le KIT mutant, l’oncogène responsable de la plupart des TIST, est entraîné par son promoteur endogène conduisant à un GIST qui imite l’apparence histologique et l’infiltrat immunitaire observés dans les GIST humains. En outre, ce modèle a été utilisé avec succès pour étudier à la fois des thérapies moléculaires et immunitaires ciblées. Nous décrivons ici l’élevage et l’entretien d’une colonie de souris KitV558Δ/+ . De plus, cet article détaille le traitement et l’approvisionnement du GIST, du ganglion lymphatique mésentérique drainant et du caecum adjacent chez les souris kitV558Δ/+ , ainsi que la préparation des échantillons pour les analyses moléculaires et immunologiques.
Introduction
GIST est le sarcome le plus fréquent chez l’homme avec une incidence d’environ 6 000 cas aux États-Unis d’Amérique1. GIST semble provenir des cellules du stimulateur cardiaque gastro-intestinal appelées cellules interstitielles de Cajal, et est généralement entraîné par une seule mutation dans la tyrosine kinase KIT ou PDGFRA2. La chirurgie est le pilier du traitement de la GIST et peut être curative, mais les patients atteints d’une maladie avancée peuvent être traités avec l’inhibiteur de la tyrosine kinase (ITK), l’imatinib. Depuis son introduction il y a plus de 20 ans, l’imatinib a transformé le paradigme de traitement dans GIST, améliorant la survie dans les maladies avancées de 1 à plus de 5 ans 3,4,5. Malheureusement, l’imatinib est rarement curatif en raison de mutations KIT acquises, de sorte que de nouveaux traitements sont nécessaires pour cette tumeur.
Les modèles murins sont un outil de recherche important dans la recherche de nouvelles thérapies contre le cancer. Plusieurs modèles de xénogreffe sous-cutanée et de xénogreffe dérivés du patient ont été développés et étudiés dans GIST 6,7. Cependant, les souris immunodéficientes ne représentent pas entièrement les GIST humains, car les TIST présentent des profils immunitaires différentiels en fonction de leur mutation oncogène, et la modification du microenvironnement tumoral gastro-intestinal améliore les effets du traitement par TKI 8,9. La souris KitV558Δ/+ a une délétion germinale hétérozygote dans l’exon 11 du Kit, qui code le domaine juxtamembranaire, le site le plus fréquemment muté dans le GIST10 humain. Les souris KitV558Δ / + développent un seul GIST cæcal avec une pénétrance de 100%, et les tumeurs ont une histologie, une signalisation moléculaire, une infiltration immunitaire et une réponse au traitement similaires à celles de la GISThumaine 8,11,12,13. Ici, nous décrivons la sélection, le traitement et l’isolement et le traitement des échantillons chez des souris KitV558Δ / + pour une utilisation dans la recherche moléculaire et immunologique dans GIST.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le modèle murin Kit V558Δ/+ est un puissant outil de recherche dans l’analyse moléculaire et immunologique du GIST. Bien que la stratégie de sélection nécessite un seul croisement, l’utilisation de cohortes de souris KitV558Δ / + dans des expériences analysant la réponse tumorale nécessite une reproduction approfondie. Les souris doivent être appariées selon l’âge et le sexe pour assurer des poids tumoraux similaires, et 10% des souris meurent avant l’âge de 8…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les souris kitV558Δ/+ ont été génétiquement modifiées et partagées par le Dr Peter Besmer10. Ce travail a été soutenu par les subventions R01 CA102613 et T32 CA251063 des NIH.
Materials
| 100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| 3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
| 4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| 70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
| AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
| Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
| HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
| KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
| Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
| Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
| p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
| p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
| PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
| Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| vivaCT 80 platform | Scanco medical |
Riferimenti
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