Molekylære og immunologiske teknikker i en genetisk konstruert musemodell av gastrointestinal stromal tumor
Summary
Målet med dette manuskriptet er å beskrive KitV558Δ/+ musemodell og teknikker for vellykket disseksjon og behandling av museprøver.
Abstract
Gastrointestinal stromal tumor (GIST) er den vanligste menneskelige sarkom og er vanligvis drevet av en enkelt mutasjon i KIT-reseptoren. På tvers av tumortyper er det utviklet mange musemodeller for å undersøke neste generasjon kreftbehandlinger. Men i GIST bruker de fleste in vivo-studier xenograftmusmodeller som har iboende begrensninger. Her beskriver vi en immunotokmpetent, genetisk konstruert musemodell av gastrointestinal stromal svulst som huser en KitV558Δ/+ mutasjon. I denne modellen er mutant KIT, oncogene ansvarlig for de fleste GISTs, drevet av sin endogene promotor som fører til en GIST som etterligner det histologiske utseendet og immuninfiltrering sett i menneskelige GISTs. Videre har denne modellen blitt brukt med hell for å undersøke både målrettede molekylære og immunterapier. Her beskriver vi avl og vedlikehold av en KitV558Δ/+ musekoloni. I tillegg beskriver dette dokumentet behandling og anskaffelse av GIST, drenering av mesenterisk lymfeknute og tilstøtende cecum i KitV558Δ/+ mus, samt prøvepreparering for molekylære og immunologiske analyser.
Introduction
GIST er den vanligste sarkom hos mennesker med en forekomst på ca 6000 tilfeller i USA1. GIST ser ut til å stamme fra de gastrointestinale pacemakercellene som kalles interstitialcellene i Cajal, og er vanligvis drevet av en enkelt mutasjon i tyrosinkinase KIT eller PDGFRA2. Kirurgi er bærebjelken i behandlingen for GIST og kan være kurativ, men pasienter med avansert sykdom kan behandles med tyrosinkinasehemmeren (TKI), imatinib. Siden introduksjonen for over 20 år siden har imatinib forvandlet behandlingsparadigmet i GIST, noe som forbedrer overlevelsen ved avansert sykdom fra 1 til over 5 år 3,4,5. Dessverre er imatinib sjelden kurativ på grunn av oppkjøpte KIT-mutasjoner, så det er behov for nye behandlinger for denne svulsten.
Musemodeller er et viktig forskningsverktøy i undersøkelsen av nye terapier i kreft. Flere subkutane xenograft- og pasientavledede xenograftmodeller er utviklet og undersøkt i GIST 6,7. Imidlertid representerer immunodeficient mus ikke fullt ut menneskelig GIST siden GISTs har differensial immunprofiler avhengig av deres onkogene mutasjon, og endring av gastrointestinal tumormikromiljø forbedrer effekten av TKI-terapi 8,9. KitV558Δ/+-musen har en heterzygot bakteriesletting i Kit exon 11, som koder juxtamembrane-domenet, det mest muterte nettstedet i humant GIST10. KitV558Δ/+ mus utvikler en enkelt cecal GIST med 100% penetrans, og svulster har lignende histologi, molekylær signalering, immuninfiltrasjon og respons på terapi som menneskelig GIST 8,11,12,13. Her beskriver vi avl, behandling og prøveisolasjon og prosessering i KitV558Δ/+ mus til bruk i molekylær og immunologisk forskning i GIST.
Protocol
Representative Results
Discussion
KitV558Δ/+ musemodellen er et kraftig forskningsverktøy i molekylær og immunologisk analyse av GIST. Selv om avlsstrategien krever et enkelt kryss, krever bruk av KitV558Δ/+ musekohorter i eksperimenter som analyserer tumorrespons omfattende avl. Mus bør være alder- og sex-matchet for å sikre lignende tumorvekter, og 10% av musene dør før 8 ukers alder når svulster etableres. Mindre omfattende avlsstrategier er mulig hvis du bruker avanserte avbildningsteknikker som CT el…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
KitV558Δ/+ mus ble genetisk konstruert og delt av Dr. Peter Besmer10. Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd R01 CA102613 og T32 CA251063.
Materials
| 100 micron filter | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1x RBC lysis buffer | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| 3mL syringe | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl | Bio-Rad | 4561083 | |
| 4% Paraformaldehyde Solution | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 40 micron filter | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| 70 micron filter | EMSCO | 1194-2350 | |
| AKT antibody (C67E7) | Cell Signaling | 4691 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | ||
| Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Complete mini edta free protease inhibitor | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Disposable Scalpels | Thermo Fisher Scientific/Exel International | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1 antibody | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Fisherbrand 850 Homogenizer | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
| HBSS | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Imatinib mesylate | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT antibody (D13A2) | Cell Signaling | 3074 | |
| KitV558Δ/+ Genotyping | Transnetyx | ||
| Microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm | Rio-Rad | 1620145 | |
| Nonfat Dry Milk | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
| p-AKT antibody (S473) | Cell Signaling | 4060 | |
| p-ERK antibody (p44/42) | Cell Signaling | 9101 | |
| p-KIT antibody (Y719) | Cell Signaling | 3391 | |
| PMSF Protease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
| Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| RPMI | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | 201154 | |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| TBS buffer (10x) | University of Pennsylvania Cell Center | ||
| Tissue culture dish (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| vivaCT 80 platform | Scanco medical |
Riferimenti
- Mastrangelo, G., et al. Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions. Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).
- Joensuu, H., DeMatteo, R. P. The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy. Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).
- Blanke, C. D., et al. Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT. Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).
- Demetri, G. D., et al. Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial. Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).
- Gold, J. S. Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors. Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).
- Huynh, H., et al. Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).
- Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
- Balachandran, V. P., et al. Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido. Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).
- Vitiello, G. A., et al. Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor. Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).
- Sommer, G., et al. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).
- Cavnar, M. J., et al. KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization. Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).
- Medina, B. D., et al. Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity. Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).
- Zhang, J. Q., et al. Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors. Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).
- . General Protocol for Western Blotting Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf (2022)
- Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking: Methods and Protocols. , 253-268 (2019).
- Sy, J., Ang, L. -. C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Biobanking: Methods and Protocols. , 269-278 (2019).
- Seifert, A. M., et al. PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors. Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).
- Liu, M., et al. Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST. Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).
- Rossi, F., et al. Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).
