エクスビボ マウス尿路上皮細胞におけるアデノウイルス-Cre媒介遺伝子欠失のオルガノイドモデル
Summary
このプロトコルは、目的の遺伝子に欠失を保有するマウス尿路上皮オルガノイドの生成および特徴付けのプロセスを記載する。この方法には、マウス尿路上皮細胞の採取、CMVプロモーターによるCre発現を駆動するアデノウイルスによるエキソビボ形質導入、およびインビトロおよびインビボ特性評価が含まれる。
Abstract
膀胱がんは、特に遺伝子組み換えマウスモデル(GEMM)において、研究が不十分な領域である。組織特異的なCreおよびloxP部位を有する近交系GEMMは、条件付きまたは誘導性遺伝子標的化のゴールドスタンダードとなっています。より迅速で効率的な実験モデルを提供するために、アデノウイルスCreおよび腫瘍抑制因子Trp53、Pten、およびRb1の複数のloxP対立遺伝子を有する正常な尿路上皮細胞を用いたエクスビボオルガノイド培養系が開発されている。正常な尿路上皮細胞は、トリプルフロックスマウスの4つの膀胱から酵素的に切断される(Trp53 f/f:Pten f/f:Rb1 f/f)。尿路上皮細胞は、CMVプロモーター(Ad5CMVCre)によって駆動されるアデノウイルス-Creを用いてエクスビボで形質導入される。形質導入された膀胱オルガノイドは、培養され、増殖され、インビトロおよびインビボで特徴付けられる。PCRは、Trp53、Pten、およびRb1における遺伝子欠失を確認するために使用されます。オルガノイドの免疫蛍光(IF)染色は、尿路上皮系譜マーカー(CK5およびp63)の陽性発現を実証する。オルガノイドは、腫瘍拡大および連続継代のために宿主マウスに皮下注射される。異種移植片の免疫組織化学(IHC)は、CK7、CK5、およびp63の陽性発現およびCK8およびウロプラキン3の陰性発現を示す。要約すると、loxP部位で操作されたマウス尿路上皮細胞からのアデノウイルス媒介遺伝子欠失は、定義された遺伝子改変の腫瘍形成能を迅速に試験するための効率的な方法である。
Introduction
膀胱がんは男性で4番目に多いがんであり、米国では毎年8万人以上が罹患しています1。プラチナベースの化学療法は、30年以上にわたり進行膀胱がん患者の標準的な治療となってきました。膀胱がん治療の展望は、免疫療法(抗PD-1および抗PD-L1免疫チェックポイント阻害剤)、エルダフィチニブ(線維芽細胞増殖因子受容体阻害剤)、およびエンフォルツマブベドチン(抗体薬物複合体)の最近の食品医薬品局(FDA)の承認によって革命をもたらしました2,3,4。しかし、化学療法または免疫療法に対する応答を予測するために臨床的に承認されたバイオマーカーは利用できない。膀胱がんの進行を駆動するメカニズムの理解を改善し、さまざまな治療モダリティの予測バイオマーカーを開発できる有益な前臨床モデルを生成することが非常に重要です。
膀胱トランスレーショナル研究における大きな障害は、ヒト膀胱癌の病因と治療応答を再現する前臨床モデルの欠如である5,6。インビトロ2Dモデル(細胞株または条件付きリプログラム細胞)、インビトロ3Dモデル(オルガノイド、3Dプリンティング)、インビボモデル(異種移植片、発がん性物質誘導モデル、遺伝子操作モデル、および患者由来異種移植片)を含む複数の前臨床モデルが開発されている2,6。遺伝子操作マウスモデル(GEMM)は、腫瘍表現型の解析、候補遺伝子および/またはシグナル伝達経路の機構的調査、および治療応答の前臨床評価など、膀胱癌生物学における多くの用途に有用である6,7。GEMMは、部位特異的リコンビナーゼ(Cre-loxP)を利用して、1つ以上の腫瘍抑制遺伝子における遺伝子欠失を制御することができる。複数の遺伝子欠失を伴う所望のGEMMを生成するプロセスは、時間がかかり、面倒で、高価である5。この方法の全体的な目標は、トリプルフロックス対立遺伝子(Trp53、Pten、およびRb1)を有する正常マウス尿路上皮細胞から膀胱トリプルノックアウト(TKO)モデルを確立するためのエクスビボCre送達の迅速かつ効率的な方法を開発することである8。エクスビボ法の主な利点は、迅速なワークフロー(マウスの繁殖の年の代わりに1〜2週間)です。この記事では、免疫適格C57 BL/6Jマウスにおいて、フロックス化対立遺伝子、エキソビボアデノウイルス形質導入、オルガノイド培養、およびインビトロおよびインビボ特性評価を有する正常な尿路上皮細胞を採取するためのプロトコルについて説明します。この方法はさらに、フロックス対立遺伝子の任意の組み合わせを保有する免疫適格マウスにおいて臨床的に関連する膀胱癌オルガノイドを生成するために使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
GEMMは、正常細胞から開始されたがんモデリングのゴールドスタンダードであり、潜在的な発癌性摂動(がん遺伝子の活性化および/または腫瘍抑制因子の喪失)の結果を厳密に試験することを可能にする。ここでは、目的の遺伝子にフロックス化対立遺伝子を担持する正常マウス尿路上皮細胞のエクスビボ遺伝子編集を介して膀胱癌オルガノイドを生成するための迅速かつ効率的なプロト…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究研究は、NIH Grants、K08CA252161(Q.L.)、R01CA234162、およびR01 CA207757(D.W.G.)、P30CA016056(NCI Cancer Center Core Support Grant)、Roswell Park Alliance Foundation、Friends of Urology Foundationによって部分的に支援されました。原稿の校正をしてくれたMarisa BlaskとMila Pakhomovaに感謝します。
Materials
| 100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
| Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
| C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
| Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
| Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
| Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
| Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
| Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
| Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
| Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
| HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
| Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
| Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
| Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
| Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
| Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
Riferimenti
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