Ex Vivo Органоидная модель аденовирусно-cre опосредованных делеций генов в уротелиальных клетках мышей
Summary
Этот протокол описывает процесс генерации и характеристики уротелиальных органоидов мыши, содержащих делеции в генах, представляющих интерес. Методы включают сбор уротелиальных клеток мыши, трансдукцию ex vivo с аденовирусом, стимулирующим экспрессию Cre с помощью промотора ЦМВ, и характеристику in vitro , а также in vivo .
Abstract
Рак мочевого пузыря является недостаточно изученной областью, особенно в генетически модифицированных моделях мышей (GEMM). Инбредные GEMM с тканеспецифическими сайтами Cre и loxP были золотыми стандартами для условного или индуцируемого нацеливания генов. Для обеспечения более быстрых и эффективных экспериментальных моделей разработана система культуры органоидов ex vivo с использованием аденовируса Cre и нормальных уротелиальных клеток, несущих множественные аллели loxP супрессоров опухоли Trp53, Pten и Rb1. Нормальные уротелиальные клетки ферментативно отделены от четырех мочевых пузырей мышей с тройным флоксом (Trp53f/f: Ptenf/f: Rb1f/f). Уротелиальные клетки трансдуцируются ex vivo с аденовирусом-Cre, приводимым в действие промотором ЦМВ (Ad5CMVCre). Трансдуцированные органоиды мочевого пузыря культивируются, размножаются и характеризуются in vitro и in vivo. ПЦР используется для подтверждения делеций генов в Trp53, Pten и Rb1. Иммунофлуоресцентное (ИФ) окрашивание органоидов демонстрирует положительную экспрессию маркеров уротелиальной линии (CK5 и p63). Органоиды вводятся подкожно мышам-хозяевам для расширения опухоли и последовательных проходов. Иммуногистохимия (IHC) ксенотрансплантатов демонстрирует положительную экспрессию CK7, CK5 и p63 и отрицательную экспрессию CK8 и Uroplakin 3. Таким образом, опосредованная аденовирусом делеция генов из уротелиальных клеток мыши, спроектированных с сайтами loxP, является эффективным методом быстрой проверки опухолевого потенциала определенных генетических изменений.
Introduction
Рак мочевого пузыря является четвертым наиболее распространенным раком у мужчин и ежегодно поражает более 80 000 человек в Соединенных Штатах1. Химиотерапия на основе платины была стандартом ухода за пациентами с прогрессирующим раком мочевого пузыря на протяжении более трех десятилетий. Ландшафт лечения рака мочевого пузыря был революционизирован недавним одобрением Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) иммунотерапии (ингибиторы иммунной контрольной точки анти-PD-1 и анти-PD-L1), эрдафитиниба (ингибитор рецептора фактора роста фибробластов) и энфортумаба ведотина (конъюгат антитело-лекарство)2,3,4. Тем не менее, клинически одобренные биомаркеры недоступны для прогнозирования ответов на химиотерапию или иммунотерапию. Существует острая необходимость в создании информативных доклинических моделей, которые могут улучшить понимание механизмов, приводящих к прогрессированию рака мочевого пузыря, и разработать прогностические биомаркеры для различных методов лечения.
Основным препятствием в трансляционных исследованиях мочевого пузыря является отсутствие доклинических моделей, которые резюмируют патогенез рака мочевого пузыря человека и ответы на лечение 5,6. Было разработано несколько доклинических моделей, включая 2D-модели in vitro (клеточные линии или условно перепрограммированные клетки), 3D-модели in vitro (органоиды, 3D-печать) и модели in vivo (ксенотрансплантат, канцероген-индуцированные, генно-инженерные модели и ксенотрансплантат, полученные от пациента)2,6. Генетически модифицированные мышиные модели (GEMM) полезны для многих применений в биологии рака мочевого пузыря, включая анализ фенотипов опухолей, механистические исследования генов-кандидатов и / или сигнальных путей и доклиническую оценку терапевтических ответов 6,7. GEMM могут использовать сайт-специфические рекомбиназы (Cre-loxP) для контроля генетических делеций в одном или нескольких генах-супрессорах опухолей. Процесс генерации желаемых GEMM с множественными делециями генов является трудоемким, трудоемким и дорогостоящим5. Общей целью этого метода является разработка быстрого и эффективного метода доставки ex vivo Cre для создания моделей тройного нокаута мочевого пузыря (TKO) из нормальных уротелиальных клеток мыши, несущих тройные флоксированные аллели (Trp53, Pten и Rb1)8. Основным преимуществом метода ex vivo является быстрый рабочий процесс (1-2 недели вместо лет разведения мышей). В этой статье описывается протокол сбора нормальных уротелиальных клеток с флокированными аллелями, трансдукцией аденовируса ex vivo, органоидными культурами, а также характеристикой in vitro и in vivo у иммунокомпетентных мышей C57 BL/6J. Этот метод может быть дополнительно использован для получения клинически значимых органоидов рака мочевого пузыря у иммунокомпетентных мышей, имеющих любую комбинацию флоксированных аллелей.
Protocol
Representative Results
Discussion
GEMM были золотыми стандартами для моделирования рака, инициированного из нормальных клеток, что позволяет тщательно тестировать последствия потенциальных онкогенных возмущений (активация онкогенов и / или потеря супрессоров опухоли). Здесь предоставляется быстрый и эффективный прото…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта исследовательская работа была частично поддержана грантами NIH, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 и R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), Roswell Park Alliance Foundation и Friends of Urology Foundation. Благодарим Марису Бласк и Милу Пахомову за корректуру рукописи.
Materials
| 100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
| Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
| C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
| Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
| Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
| Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
| Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
| Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
| Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
| Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
| HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
| Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
| Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
| Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
| Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
| Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
Riferimenti
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2021. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).
- Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
- DeGraff, D. J., et al. Current preclinical models for the advancement of translational bladder cancer research. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (2), 121-130 (2013).
- Andreev-Drakhlin, A. Y., et al. The evolving treatment landscape of advanced urothelial carcinoma. Current Opinion in Oncology. 33 (3), 221-230 (2021).
- Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4567-4574 (2019).
- Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews. Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
- Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Fujii, E., et al. A simple method for histopathological evaluation of organoids. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 81-85 (2018).
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49f(high) mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communication. 10 (1), 4407 (2019).
- Wang, L., et al. A genetically defined disease model reveals that urothelial cells can initiate divergent bladder cancer phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 563-572 (2020).
- Yang, D., et al. Intertumoral heterogeneity in SCLC is influenced by the cell type of origin. Cancer Discovery. 8 (10), 1316-1331 (2018).
- Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
- Bottger, F., et al. Tumor heterogeneity underlies differential cisplatin sensitivity in mouse models of small-cell lung cancer. Cell Reports. 27 (11), 3345-3358 (2019).
- Puzio-Kuter, A. M., et al. Inactivation of p53 and Pten promotes invasive bladder cancer. Genes & Development. 23 (6), 675-680 (2009).
- Park, S., et al. Novel mouse models of bladder cancer identify a prognostic signature associated with risk of disease progression. Ricerca sul cancro. 81 (20), 5161-5175 (2021).
- Hawley, S. P., Wills, M. K., Jones, N. Adenovirus-mediated genetic removal of signaling molecules in cultured primary mouse embryonic fibroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (43), e2160 (2010).
- Feng, W., et al. Rapid interrogation of cancer cell of origin through CRISPR editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (32), 2110344118 (2021).
