Isolamento de Preadipócitos de Embriões de Broiler Chick
Summary
O presente protocolo descreve um método simples para isolar pré-apócitos do tecido adiposo em embriões de frango. Este método permite o isolamento com alto rendimento, cultura primária e diferenciação adipogênica de pré-apócitos. Manchas de óleo Vermelho O e mancha lipídica/DNA mediram a capacidade adipogênica de células isoladas induzidas com meios de diferenciação.
Abstract
Pré-iadipócitos primários são um valioso sistema experimental para entender as vias moleculares que controlam a diferenciação e o metabolismo adipócitos. Embriões de frango oferecem a oportunidade de isolar os pré-idócitos do estágio inicial do desenvolvimento adiposo. Esta célula primária pode ser usada para identificar fatores que influenciam a proliferação de pré-doenças e a diferenciação adipogênica, tornando-as um modelo valioso para estudos relacionados à obesidade infantil e controle do excesso de deposição de gordura em aves de capoeira. O rápido crescimento do tecido adiposo pós-natal efetivamente desperdiça ração, alocando-o longe do crescimento muscular em frangos de corte. Portanto, métodos para entender os estágios iniciais do desenvolvimento de tecidos adiposos podem fornecer pistas para regular essa tendência e identificar maneiras de limitar a expansão adiposa no início da vida. O presente estudo foi concebido para desenvolver um método eficiente de isolamento, cultura primária e diferenciação adipogênica de pré-iadipócitos isolados do desenvolvimento de tecido adiposo de embriões de filhotes de frango comercial (tipo carne). O procedimento foi otimizado para produzir células com alta viabilidade (~98%) e capacidade aumentada de diferenciação em adipócitos maduros. Este método simples de isolamento, cultura e diferenciação pré-apócis embrionárias suporta análises funcionais de crescimento e desenvolvimento de gordura no início da vida.
Introduction
A obesidade é uma ameaça à saúde global para adultos e crianças. Crianças com sobrepeso ou obesidade têm aproximadamente cinco vezes mais chances de serem obesas quando adultos, colocando-as em risco significativamente aumentado para doenças cardiovasculares, diabetes e muitas outras comorbidades. Cerca de 13,4% das crianças norte-americanas de 2 a 5 anos têm obesidade1, ilustrando que a tendência de acumular excesso de gordura corporal pode ser iniciada muito cedo na vida. Por razões muito diferentes, o acúmulo de excesso de tecido adiposo é uma preocupação para frangos de corte (tipo carne). Os frangos modernos são incrivelmente eficientes, mas ainda acumulam mais lipídios do que é fisiologicamente necessário 2,3. Essa tendência começa logo após o hatch e efetivamente desperdiça ração, o componente de produção mais caro, alocando-o longe do crescimento muscular. Portanto, tanto para crianças quanto para galinhas de corte, embora por razões muito diferentes, há a necessidade de entender fatores que influenciam o desenvolvimento de tecidos adiposos e identificar maneiras de limitar a expansão adiposa no início da vida.
Os adipócitos formam-se de pré-apócitos, células-tronco derivadas de tecido adiposo que sofrem diferenciação para desenvolver células de gordura maduras e armazenadas por lipídios. Assim, os pré-apócitos in vitro são um modelo experimental valioso para estudos de obesidade. Essas células, isoladas da fração vascular estromica dos depósitos adiposos, podem fornecer uma compreensão fundamental das vias moleculares que controlam a diferenciação de adipócitos e o metabolismo 4,5. Os embriões de pintinhos são um modelo experimental favorável em estudos de desenvolvimento porque a colheita de ovos no cronograma desejado facilita a manipulação experimental, pois permite a obtenção de embriões sem o sacrifício da mãe para observar uma série de estágios de desenvolvimento de embriões. Além disso, procedimentos cirúrgicos complicados e longos períodos de tempo não são necessários para obter embriões relativos a modelos animais maiores. Portanto, o embrião do filhote apresenta uma oportunidade de obter pré-nascidos desde os estágios iniciais do desenvolvimento do tecido adiposo. O tecido adiposo subcutâneo torna-se visível no filhote em torno do dia embrionário 12 (E12) como um depósito claramente definido localizado ao redor da coxa. Este depósito é enriquecido em pré-iadipócitos altamente proliferativos que passam ativamente por diferenciação sob pistas de desenvolvimento para formar adipócitos maduros 6,7. O processo de diferenciação adipogênica é comparável entre galinhas e humanos. Portanto, preadipócitos isolados de embriões de filhotes podem ser usados como modelo de dupla finalidade para estudos relevantes para humanos e aves. No entanto, o rendimento dos preadipócitos diminui com o envelhecimento à medida que as células crescem em adipócitos maduros5.
O presente protocolo otimiza o isolamento de pré-nascidos do tecido adiposo durante a etapa (E16-E18) em que a diferenciação adipogênica e a hipertrofia adipócite estão no seu auge em embriões de filhotesde corte 8. Este procedimento pode avaliar os efeitos de fatores aos quais o embrião em desenvolvimento está exposto no ovo, como a dieta da galinha, sobre o desenvolvimento de adipócitos e potencial adipogênico ex vivo. Também pode testar o impacto de várias manipulações (por exemplo, hipóxia, adições de nutrientes, agonistas farmacológicos e antagonistas) sobre adipogênese ou os vários ‘omes (por exemplo, transcrito, metabolome, metilome) de progenitores adipócitos. Como representação do estágio inicial da formação adiposa, as células obtidas usando este protocolo são modelos valiosos para estudos relevantes para aves e seres humanos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora vários protocolos bem descritos tenham relatado o isolamento de pré-doenças 14,15,16,17, o isolamento para preadipócitos embrionários foi otimizado, o que pode ser usado para análises funcionais do crescimento e desenvolvimento de gorduras no início da vida. Este protocolo produz progenitores adipócidos embrionários de alta viabilidade com alto potencial de diferenciação. Alé…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem à UT AgResearch e ao Departamento de Zootecnia por apoiarem e otimizarem esse protocolo. Este trabalho foi financiado por subvenção do USDA.
Materials
| 1 mL Pipette | Eppendorf | Z683825 | Single Channel Pipette, 100 – 1000 µL |
| 1 mL Pipette Tip | Fisher Scientific | 02-707-402 | |
| 100% Isopropanol | Fisher Scientific | A426P4 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010023 | |
| 25 mL Flask | Pyrex | 4980-25 | |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F75P-1GAL | |
| 6-Well Plate | Falcon | 353046 | Tissue Culture-treated |
| 96-Well Assay Plate | Costar | 3632 | |
| 96-Well Plate, Black Bottom | Costar | 3603 | Tissue Culture-treated |
| AdipoRed | Lonza | PT-7009 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290026 | |
| Bench Top Wiper (Kimtechwiper) | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Betadine | Up & Up | NDC 1167300334 | 20% Working Solution |
| Cell Counter | Corning | 6749 | |
| Cell Strainer, 40 µm | SPL | 93040 | |
| Centrifugaton | Eppendorf | 5702 | |
| Chicken Serum | Gibco | 16110082 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | VWR | 10025-690 | |
| Conical Centrifuge Tubes, 50 mL | Falcon | 352098 | |
| Cryovial | Nunc | 343958 | |
| Curved Forceps, 100 mm | Roboz Surgical | RS-5137 | |
| Curved Surgical Scissors, 115 mm | Roboz Surgical | RS-6839 | |
| Distilled Water | Millipore | SYNSV0000 | Despensed as needed |
| DMEM/F12 | HyClone | SH30023.01 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | 70% Working Solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| Fluorescent Microscope | Evos | M7000 | |
| Fluorescent Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Foil | Reynolds | Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT. | |
| Freezing Container | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
| Gelatin | Millipore | 4055 | 2% Working Solution |
| Hematocytometer (Counting Chamber) | Corning | 480200 | 0.1 mm deep |
| Incubator | Fisher Scientific | 6845 | |
| Instrument Sterilizer | VWR | B1205 | |
| Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin | Sigma | L9655 | 1x Working Solution |
| Microscope | Evos | AMEX1000 | |
| Multi-Channel Pipette | Thermo Scientific | 4661070 | 12-Channel Pipetters, 30 – 300 µL |
| Na2HPO4 | Sigma | S-7907 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S-3139 | |
| NucBlue | Invitrogen | R37605 | |
| Oil Red O | Sigma | O-0625 | |
| Orbital Shaker | IKA | KS130BS1 | |
| Paper Towel | Tork | RK8002 | |
| Parafilm | Parafilm M | PM996 | |
| Penicillin/Steptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | 1x Working Solution |
| Petri dishes, 100 mm | Falcon | 351029 | |
| Petri dishes, 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Plate Shaker | VWR | 200 | |
| RBC Lysis Buffer | Roche | 11814389001 | |
| Reagent Reservior | VWR | 89094-680 | |
| Small Beaker, 100 mL | Pyrex | 1000-100 | |
| Spectrophotometer Plate Reader | Biotek | Synergy H1 | |
| Sterile Gauze | McKesson | 762703 | |
| Straight Forceps, 120 mm | Roboz Surgical | RS-4960 | |
| Straight Scissors, 140 mm | Roboz Surgical | RS-6762 | |
| T-25 Flask | Corning | 430639 | Tissue Culture-treated |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Tissue Strainer, 250 µm | Pierce | 87791 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin | Gibco | 15400054 | 0.1% Working Solution |
| Tweezers, 110 mm | Roboz Surgical | RS-5035 | |
| Type 1 Collagenase | Gibco | 17100017 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-110 |
Riferimenti
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