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Bioingegneria

Fragmentation d’hydrogels en vrac et transformation en hydrogels granulaires pour des applications biomédicales

Published: May 17, 2022
doi:
10.3791/63867
Victoria G. Muir1, Margaret E. Prendergast1, Jason A. Burdick1,2,3
1Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences,University of Pennsylvania, 2BioFrontiers Institute,University of Colorado Boulder, 3Department of Chemical and Biological Engineering, College of Engineering and Applied Science,University of Colorado Boulder

Summary

Ce travail décrit des méthodes simples, adaptables et peu coûteuses pour fabriquer des microgels avec fragmentation par extrusion, transformer les microgels en hydrogels granulaires injectables et appliquer les hydrogels granulaires comme encres d’impression par extrusion pour des applications biomédicales.

Abstract

Les hydrogels granulaires sont des assemblages coincés de microparticules d’hydrogel (c.-à-d. des « microgels »). Dans le domaine des biomatériaux, les hydrogels granulaires ont de nombreuses propriétés avantageuses, notamment l’injectabilité, la porosité à l’échelle microscopique et l’accordabilité en mélangeant plusieurs populations de microgels. Les méthodes de fabrication de microgels reposent souvent sur des émulsions eau-dans-huile (par exemple, microfluidique, émulsions par lots, électrodéfection) ou la photolithographie, qui peuvent présenter des exigences élevées en termes de ressources et de coûts, et peuvent ne pas être compatibles avec de nombreux hydrogels. Ce travail détaille des méthodes simples mais très efficaces pour fabriquer des microgels en utilisant la fragmentation par extrusion et pour les transformer en hydrogels granulaires utiles pour des applications biomédicales (par exemple, les encres d’impression 3D). Tout d’abord, les hydrogels en vrac (en utilisant l’acide hyaluronique photoréticable (HA) comme exemple) sont extrudés à travers une série d’aiguilles avec des diamètres séquentiellement plus petits pour former des microgels fragmentés. Cette technique de fabrication de microgel est rapide, peu coûteuse et hautement évolutive. Les méthodes de bourrage des microgels en hydrogels granulaires par centrifugation et filtration sous vide sont décrites, avec une post-réticulation facultative pour la stabilisation de l’hydrogel. Enfin, les hydrogels granulaires fabriqués à partir de microgels fragmentés sont présentés comme des encres d’impression par extrusion. Bien que les exemples décrits ici utilisent l’HA photoréticable pour l’impression 3D, les méthodes sont facilement adaptables à une grande variété de types d’hydrogel et d’applications biomédicales.

Introduction

Les hydrogels granulaires sont fabriqués par l’emballage de particules d’hydrogel (c.-à-d. des microgels) et constituent une classe passionnante de biomatériaux possédant de nombreuses propriétés avantageuses pour les applications biomédicales 1,2,3. En raison de leur structure particulaire, les hydrogels granulaires sont amincissants par cisaillement et auto-cicatrisants, ce qui permet leur utilisation comme (bio)encres d’impression par extrusion, supports granulaires pour l’impression intégrée et thérapeutiques injectables 4,5,6,7,8,9. De plus, l’espace vide entre les microgels fournit une porosité à l’échelle microscopique pour le mouvement cellulaire et la diffusion moléculaire 8,10,11. De plus, plusieurs populations de microgels peuvent être combinées en une seule formulation pour permettre une accordabilité et une fonctionnalité matérielleaméliorées 8,10,12,13. Ces propriétés importantes ont motivé l’expansion rapide du développement de l’hydrogel granulaire au cours des dernières années.

Il existe une gamme de méthodes disponibles pour former des microgels vers la fabrication d’hydrogel granulaire, chacune avec ses propres avantages et inconvénients. Par exemple, les microgels sont souvent formés à partir d’émulsions eau-dans-huile utilisant des microfluidiques gouttelettes 4,11,13,14,15,16,17, des émulsions par lots 7,18,19,20,21,22 ou de l’électropulvérisation 6,23, 24,25. Ces méthodes donnent des microgels sphériques de diamètres uniformes (microfluidiques) ou polydispersés (émulsions discontinues, électropulvérisation). Il existe certaines limites à ces méthodes de fabrication d’émulsions eau-dans-huile, notamment la production potentiellement à faible débit, la nécessité de solutions de précurseurs d’hydrogel à faible viscosité et le coût et les ressources élevés pour la mise en place. De plus, ces protocoles peuvent nécessiter des huiles et des tensioactifs agressifs qui doivent être lavés des microgels à l’aide de procédures qui ajoutent des étapes de traitement, et peuvent être difficiles à traduire en conditions stériles pour des applications biomédicales dans de nombreux laboratoires. Éliminant le besoin d’émulsions eau-dans-huile, la (photo)lithographie peut également être utilisée, où des moules ou des photomasques sont utilisés pour contrôler le durcissement de microgels à partir de solutions de précurseurs d’hydrogel 1,26,27. Comme la microfluidique, ces méthodes peuvent être limitées dans leur débit de production, ce qui est un défi majeur lorsque de grands volumes sont nécessaires.

Comme alternative à ces méthodes, la fragmentation mécanique des hydrogels en vrac a été utilisée pour fabriquer des microgels de tailles irrégulières 19,28,29,30,31,32. Par exemple, les hydrogels en vrac peuvent être préformés et ensuite passés à travers des mailles ou des tamis pour former des microgels fragmentés, un processus qui a même été effectué en présence de cellules dans des brins de microgel33,34. Les hydrogels en vrac ont également été transformés en microgels avec perturbation mécanique en utilisant des techniques telles que le broyage avec du mortier et du pilon ou par l’utilisation de mélangeurs commerciaux 35,36,37. D’autres ont également eu recours à l’agitation mécanique lors de la formation d’hydrogels pour fabriquer des microgels fragmentés (c.-à-d. des gels fluides)31.

Les méthodes décrites ici développent ces techniques de fragmentation mécanique et présentent une approche simple pour fabriquer des microgels avec fragmentation par extrusion, en utilisant des hydrogels d’acide hyaluronique (HA) photoréticables comme exemple. La fragmentation par extrusion utilise uniquement des seringues et des aiguilles pour fabriquer des microgels fragmentés dans une méthode peu coûteuse, à haut débit et facilement évolutive qui convient à une large gamme d’hydrogels19,32. De plus, les méthodes d’assemblage de ces microgels fragmentés en hydrogels granulaires sont décrites en utilisant soit la centrifugation (faible emballage), soit la filtration sous vide (emballage élevé). Enfin, l’application de ces hydrogels granulaires fragmentés est discutée pour une utilisation comme encre d’impression par extrusion. L’objectif de ce protocole est d’introduire des méthodes simples qui s’adaptent à une grande variété d’hydrogels et peuvent être mises en œuvre dans pratiquement tous les laboratoires intéressés par les hydrogels granulaires.

Protocol

1. Fabrication d’hydrogels en vrac à l’intérieur d’une seringue à l’aide de la photocroisillonnage REMARQUE : La figure 1 présente un aperçu de la fabrication d’hydrogel en vrac à l’intérieur d’une seringue à l’aide de la photoréticulation. Ce protocole utilise de l’acide hyaluronique modifié par norbornène (NorHA) pour fabriquer des hydrogels en vrac à l’aide d’une réaction thiol-ène photo-médiée. Les procédur…

Representative Results

Les résultats représentatifs de ces protocoles sont présentés à la figure 3 et à la figure 6. La fragmentation par extrusion donne des microgels avec des formes polygonales déchiquetées avec des diamètres allant de 10 à 300 μm (Figure 3). De plus, la circularité varie de 0,2 (non circulaire) à près de 1 (cercle parfait), et le rapport d’aspect varie de 1 à 3 (Figure 3). Ces paramètres …

Discussion

Ici, les méthodes de fabrication d’hydrogels granulaires à l’aide de microgels fragmentés par extrusion et d’emballage par centrifugation ou filtration sous vide sont décrites. Comparée à d’autres méthodes de fabrication de microgels (c.-à-d. microfluidique, émulsions par lots, électropulvérisation, photolithographie), la fabrication de microgels à fragmentation par extrusion est très rapide, peu coûteuse, facilement évolutive et se prête à une grande variété de systèmes d’hydrogel. De plus,…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation par le biais du programme UPenn MRSEC (DMR-1720530) et des bourses de recherche d’études supérieures (à V.G.M et M.E.P.) et les National Institutes of Health (R01AR077362 à J.A.B.).

Materials

15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube Corning 430766
30 G NT Premium Series Dispensing Tip Jensen Global JG30-0.5HPX Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5" needle. Various sizes are available.
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL) Fisher Scientific 14-823-435 Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX).
Black folders Various Vendors
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5") Grainger 5FVH5 Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5" needle. Various sizes are available.
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5") Grainger 5FVJ3
Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5") Grainger 5FVL0
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific 14190-250 Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles.
Durapore Membrane Filter, 0.22 µm Millipore GVWP04700
Epifluorescent or confocal microscope Various Vendors To visualize microgels and granular hydrogels
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes Fisher Scientific 05-402-25
Extrusion printer Custom-built Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX.
Filter Adapters Fisher Scientific 05-888-107 Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX).
Filter Flask Various Vendors
Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa) Sigma-Aldrich 52471
Glass microscope slide Various Vendors
ImageJ National Institutes of Health "Analyze Particles" information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html
Laptop Various Vendors
Luer-Lock Tip Caps Integrated Dispensin g Solutions 9991329
Metal spatula for scooping Various Vendors
Microcentrifuge Various Vendors Capable of speed up to 18,000 x g
Microscoft Execl Microsoft Other programs can be used, such as Google Slides.
OmniCure S2000 Spot UV Curing System Excelitas Technologies S2000 Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired.
Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate Fisher Scientific FB966C Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available.
Radiometer Various Vendors
Repetier Host Hot-World GmbH & Co. KG 3D printing software
Screw-based extrusion printer Various Vendors This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available.
Solidworks/CAD software Dassault Systèmes SolidWorks Corporation Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD.
Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line Various Vendors
UV Eye Protection (i.e., safety glasses) Various Vendors
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Riferimenti

  1. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
  2. Qazi, T. H., Burdick, J. A. Granular hydrogels for endogenous tissue repair. Biomaterials and Biosystems. 1 (November 2020), 100008 (2021).
  3. Riley, L., Schirmer, L., Segura, T. Granular hydrogels: emergent properties of jammed hydrogel microparticles and their applications in tissue repair and regeneration. Current Opinion in Biotechnology. 60, 1-8 (2019).
  4. Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
  5. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  6. Xin, S., Chimene, D., Garza, J. E., Gaharwar, A. K., Alge, D. L. Clickable PEG hydrogel microspheres as building blocks for 3D bioprinting. Biomaterials Science. 7 (3), 1179-1187 (2019).
  7. Hirsch, M., Charlet, A., Amstad, E. 3D printing of strong and tough double network granular hydrogels. Advanced Functional Materials. 31 (5), 2005929 (2021).
  8. Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644 (2021).
  9. Xin, S. et al. Generalizing hydrogel microparticles into a new class of bioinks for extrusion bioprinting. Science Advances. 7 (42), eabk3087 (2021).
  10. de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
  11. Qazi, T. H. et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2021).
  12. Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1-8 (2018).
  13. Hsu, R. S. et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
  14. Sheikhi, A. et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192 (September 2018), 560-568 (2019).
  15. Griffin, D. R. et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
  16. Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 1-12 (2021).
  17. Feng, Q. et al. Engineering the cellular mechanical microenvironment to regulate stem cell chondrogenesis: Insights from a microgel model. Acta Biomaterialia. 113, 393-406 (2020).
  18. Caldwell, A. S., Rao, V. V., Golden, A. C., Anseth, K. S. Porous bio-click microgel scaffolds control hMSC interactions and promote their secretory properties. Biomaterials. 232 (December 2019), 119725 (2020).
  19. Muir, V. G., Qazi, T., Shen, J., Groll, J., Burdick, J. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
  20. Jivan, F. et al. Sequential thiol-ene and tetrazine click reactions for the polymerization and functionalization of hydrogel microparticles. Biomacromolecules. 17 (11), 3516-3523 (2016).
  21. Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in microporous annealed particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
  22. Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
  23. Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1-7 (2018).
  24. Isaac, A. et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
  25. Xin, S., Gregory, C. A., Alge, D. L. Interplay between degradability and integrin signaling on mesenchymal stem cell function within poly(ethylene glycol) based microporous annealed particle hydrogels. Acta Biomaterialia. 101, 227-236 (2020).
  26. Yao, M. H. et al. Directed self-assembly of polypeptide-engineered physical microgels for building porous cell-laden hydrogels. Chemical Communications. 50 (66), 9405-9408 (2014).
  27. Han, Y. L. et al. Directed self-assembly of microscale hydrogels by electrostatic interaction. Biofabrication. 5 (3) 035004 (2013).
  28. Gehlen, D. B. et al. Granular cellulose nanofibril hydrogel scaffolds for 3D cell cultivation. Macromolecular Rapid Communications. 41 (18), 2000191 (2020).
  29. Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
  30. Hsu, C. C. et al. Increased connectivity of hiPSC-derived neural networks in multiphase granular hydrogel scaffolds. Bioactive Materials. 9, 358-372 (2021).
  31. Feig, V. R. et al. Conducting polymer-based granular hydrogels for injectable 3D cell scaffolds. Advanced Materials Technologies. 6 (6), 2100162 (2021).
  32. Zhang, H. et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Advanced Functional Materials. 30 (13), 1-10 (2020).
  33. Sinclair, A. et al. Self-healing zwitterionic microgels as a versatile platform for malleable cell constructs and injectable therapies. Advanced Materials. 30 (39), 1803087 (2018).
  34. Kessel, B. et al. 3D bioprinting of macroporous materials based on entangled hydrogel microstrands. Advanced Science. 7 (18), 2001419 (2020).
  35. Hinton, T. J. et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
  36. Koetting, M. C., Guido, J. F., Gupta, M., Zhang, A., Peppas, N. A. pH-responsive and enzymatically-responsive hydrogel microparticles for the oral delivery of therapeutic proteins: Effects of protein size, crosslinking density, and hydrogel degradation on protein delivery. Journal of Controlled Release. 221, 18-25 (2016).
  37. Heo, D. N. et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  38. Gramlich, W. M., Kim, I. L., Burdick, J. A. Synthesis and orthogonal photopatterning of hyaluronic acid hydrogels with thiol-norbornene chemistry. Biomaterials. 34 (38), 9803-9811 (2013).
  39. Muir, V. G. et al. Sticking together: Injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. 2201115 (2022).
  40. Qazi, T. H., Muir, V. G., Burdick, J. A. Methods to characterize granular hydrogel rheological properties, porosity, and cell invasion. ACS Biomaterials Science & Engineering. In Press (2022).
  41. Daly, A. C., Prendergast, M. E., Hughes, A. J., Burdick, J. A. Bioprinting for the biologist. Cell. 184 (1), 18-32 (2021).
  42. Pakhomova, C., Popov, D., Maltsev, E., Akhatov, I., Pasko, A. Software for bioprinting. International Journal of Bioprinting. 6 (3), 41-61 (2020).
  43. Junk, S., Kuen, C. Review of open source and freeware CAD systems for use with 3D-printing. Procedia CIRP. 50, 430-435 (2016).
  44. Bessler, N. et al. Nydus one syringe extruder (NOSE): A Prusa i3 3D printer conversion for bioprinting applications utilizing the FRESH-method. HardwareX. 6, e00069 (2019).
  45. Skardal, A. et al. Bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 110, 53606 (2016).
  46. Thayer, P. S., Orrhult, L. S., Martínez, H. Bioprinting of cartilage and skin tissue analogs utilizing a novel passive mixing unit technique for bioink precellularization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 131, 56372 (2018).
  47. Pusch, K., Hinton, T. J., Feinberg, A. W. Large volume syringe pump extruder for desktop 3D printers. HardwareX. 3 (November 2017), 49-61 (2018).
  48. Ding, A. et al. Jammed micro-flake hydrogel for 4D living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), e2109394 (2022).

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Muir, V. G., Prendergast, M. E., Burdick, J. A. Fragmenting Bulk Hydrogels and Processing into Granular Hydrogels for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (183), e63867, doi:10.3791/63867 (2022).
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