클라미도모나스 라인하르티이에서 파괴된 세포 모델의 재활성화
Summary
운동성 세포의 시험관내 재활성화는 세포 운동성의 메카니즘을 이해하는 데 있어서 중요한 실험이다. 이 프로토콜은 실리아 / 편모를 연구하는 모델 유기체 인 Chlamydomonas reinhardtii의 탈상 된 세포 모델을 다시 활성화하는 것을 설명합니다.
Abstract
Szent-Györgyi가 20 세기 중반에 입증 한 ATP를 추가하여 글리세린 화 된 근육의 수축에 대한 역사적인 실험 이후, 탈embranated 세포의 시험관 내 재활성화는 세포 운동성을 조사하는 전통적이고 강력한 방법이었습니다. 이 실험 방법의 근본적인 이점은 재활성화 용액의 조성이 쉽게 변경될 수 있다는 것이다. 예를 들어, 생체 내에서 막 여기로 인해 일시적으로 발생하는 높은Ca2+ 농도 환경은 실험실에서 복제될 수 있다. 진핵 섬모 (일명 편모)는 규제 메커니즘이 여전히 명확 해져야하는 정교한 운동성 기계입니다. 단세포 녹색 alga Chlamydomonas reinhardtii는 섬모의 연구 분야에서 우수한 모델 유기체입니다. C. reinhardtii의 탈embranated 세포 모델과 단리된 섬모의 탈입된 축삭과 같은 이들의 유도체를 사용한 재활성화 실험은 섬모 운동성의 분자 메커니즘을 이해하는 데 크게 기여하였다. 이러한 실험은 ATP가 섬모 운동성에 활력을 불어 넣고Ca2+, cAMP 및 반응성 산소 종을 포함한 다양한 세포 신호가 섬모 운동을 조절한다는 것을 분명히했습니다. C. reinhardtii 세포의 탈형 및 세포 모델의 재활성화를 위한 정확한 방법이 여기에 기술되어 있다.
Introduction
탈embranated 운동성 세포의 시험관내 재활성화는 세포 운동성의 조절 메카니즘에 대한 분자 기초를 연구하기 위한 유용한 도구이다. Szent-Györgyi는 아데노신 트리포스페이트(ATP)1를 첨가하여 50% 글리세롤로 추출한 토끼 골격근 섬유의 시험관내 수축을 처음으로 입증했습니다. 이 실험은 ATP가 근육 수축에 활력을 불어 넣는다는 것을 증명한 최초의 실험이었습니다. 이 방법론은 곧 정자 편모2, Paramecium cilia3 및 Chlamydomonas reinhardtii cilia (편모라고도 함)4와 같은 ATP 에너지 섬모 / 편모 운동성에 대한 연구에 적용되었습니다 demembranation을위한 비 이온성 세제를 사용합니다.
단세포 녹색 알가 C. reinhardtii는 섬모를 연구하기위한 모델 유기체입니다 : 그것은 인간의 가슴 스트로크처럼 그들을 때려 두 섬모로 수영합니다 5. 섬모 운동은 마이너스 엔드 지향 미세 소관 기반 모터 단백질 6,7 인 dynein에 의해 구동됩니다. 섬모 다이닌은 바깥쪽 팔 다이닌과 안쪽 팔 다이네인으로 분류 할 수 있습니다. 각 종류의 다이닌이 결여된 돌연변이체는 서로 다른 운동성 이상을 갖는 느린 수영 돌연변이체로서 단리되었다. 이들 돌연변이체의 상세한 시험관내 운동성 분석은 상당히 진보된 다인 연구8을 갖는다.
탈embranated C. reinhardtii 세포 (세포 모델)의 시험관내 재활성화 실험이 확립 된 이래로이 방법 및 그의 유도체를 활용하여 많은 중요한 발견이 달성되었습니다. 일련의 Ca2+ 완충제에서 세포 모델의 재활성화는, 예를 들어,2개의 섬모가 서브마이크로몰Ca2+에 의해 상이하게 조절된다는 것을 9개 보여주었고, 이러한 비대칭 섬모 조절은 C. 라인하르티이10의 광전술적 배향을 가능하게 한다. 또한, 두 섬모는 순방향 수영 모드 (비대칭 파형이라고 함)에서 후진 수영 모드 (세포가 광압 또는 메카노 충격을받을 때 짧은 기간 동안 나타나는 대칭 파형이라고 함)11,12로 파형 변환을 보여줍니다. 이러한 파형 변환은 아밀리몰Ca2+에 의해 조절되며, 이는 소위 핵편모성 장치(2개의 섬모, 기저체, 기저체와 핵을 연결하는 구조, 및 핵의 잔재를 포함하는 복합체)11 또는 분리된 섬모(13)의 탈embranated 축삭체의 재활성화에 의해 나타났다. Ca2+ 이외에, 산화환원(reduction-oxidation) 포이즈는 섬모 박동 빈도를 조절하는 신호이며, 이는 환원된 글루타티온 대 산화된 글루타티온14의 상이한 비율을 함유하는 산화환원 완충제에서 세포 모델의 재활성화에 의해 나타났다. 또한, 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(cAMP)는 두 개의 섬모를 비대칭적으로 조절하며, 이는 광절단가능한 캐싱된 cAMP15를 사용한 액소네메스의 재활성화에 의해 나타났다. 이러한 시험관 내 발견은 유전 적 발견과 결합하여 C. reinhardtii에서 섬모 조절의 분자 메커니즘에 대한 더 깊은 이해를 이끌어 냈습니다.
세포 모델을 재활성화하기 위한 프로토콜이 여기에 기술되어 있다. 이 방법은 간단하고, 다양한 변형을 허용하며, 섬모와 함께 움직이는 여러 유기체에 적용될 수 있습니다. 그러나, 탈취된 세포는 깨지기 쉽기 때문에, 붕괴를 방지하면서 좋은 효율로 세포 모델의 운동성을 재활성화하기 위한 몇 가지 팁이 필요하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 demembranation으로 알려진 과정으로, 부드럽지만 철저하게 수행되어야합니다. 감소(즉, 세포체로부터 섬모의 분리)는 격렬한 피펫팅 또는 볼텍싱에 의해 유도되고, ATP의 첨가 후에도 세포 모델을 움직이지 않게 만든다. 전형적으로, 5 × 10,7 세포는 ~0.5 mL의 탈지 완충액에 현탁된다(최종 세포 밀도: 1 × 108 세포/mL). 세포 모델…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 일본 과학 진흥 협회 KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html)에서 N.U. (19K23758, 21K06295) 및 K.W. (19H03242, 20K21420, 21H00420), Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/)에서 K.W.로, 그리고 인간, 환경 및 재료 브리징을위한 동적 얼라이언스 (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/)에서 N.U. 및 K.W.에 대한 보조금으로 지원되었습니다. 시노하라 미유키 여사(호세이 대학교)에게 피겨 준비에 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다.
Materials
| 0.5 mL plastic tube | QSP | 502-PLN-Q | |
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sima-Aldrich | A2383 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strain CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| Creatine kinase | Merck | CK-RO | |
| Creatine phosphate | Merck | CRPHO-RO | |
| Dithiothreitol (DTT) | Nakalai tesque | 14128-46 | |
| GEDTA(EGTA) | Dojindo | G002 | |
| Hepes | Dojindo | GB70 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich. |
| MgSO4-7H2O | Nakalai tesque | 21002-85 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Pasteur pipette | fisher scientific | 13-678-20C | |
| Polyethylene glycol, Mr 20,000 | Merck | 8.18897.1000 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Sodium Hydroxide | Nacalai | 31511-05 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
Riferimenti
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