Reaktivierung demembranierter Zellmodelle in Chlamydomonas reinhardtii
Summary
Die In-vitro-Reaktivierung beweglicher Zellen ist ein entscheidendes Experiment zum Verständnis der Mechanismen der Zellmotilität. Das Protokoll beschreibt die Reaktivierung der demembranierten Zellmodelle von Chlamydomonas reinhardtii, einem Modellorganismus zur Untersuchung von Zilien / Flagellen.
Abstract
Seit dem historischen Experiment zur Kontraktion glykerinierter Muskeln durch Zugabe von ATP, das Szent-Györgyi Mitte des 20. Jahrhunderts demonstrierte, ist die In-vitro-Reaktivierung demembranierter Zellen ein traditioneller und wirksamer Weg, um die Zellmotilität zu untersuchen. Der grundlegende Vorteil dieser experimentellen Methode besteht darin, dass die Zusammensetzung der Reaktivierungslösung leicht verändert werden kann. Zum Beispiel kann eine Umgebung mit hoher Ca2 + – Konzentration, die aufgrund der Membrananregung in vivo nur vorübergehend auftritt, im Labor repliziert werden. Eukaryotische Zilien (auch bekannt als Flagellen) sind ausgeklügelte Motilitätsmechanismen, deren Regulationsmechanismen noch geklärt werden müssen. Die einzellige Grünalge Chlamydomonas reinhardtii ist ein hervorragender Modellorganismus im Forschungsgebiet der Zilien. Die Reaktivierungsexperimente mit demembranierten Zellmodellen von C. reinhardtii und ihren Derivaten, wie demembranierten Axonemen isolierter Zilien, haben wesentlich zum Verständnis der molekularen Mechanismen der Ziliarmotilität beigetragen. Diese Experimente stellten klar, dass ATP die Ziliarmotilität anregt und dass verschiedene zelluläre Signale, einschließlich Ca2 +, cAMP und reaktive Sauerstoffspezies, Ziliarbewegungen modulieren. Die genaue Methode zur Demembranation von C. reinhardtii-Zellen und zur Reaktivierung der Zellmodelle wird hier beschrieben.
Introduction
Die In-vitro-Reaktivierung demembranierter beweglicher Zellen ist ein wertvolles Werkzeug, um die molekularen Grundlagen für den Regulationsmechanismus der Zellmotilität zu untersuchen. Szent-Györgyi zeigte erstmals eine In-vitro-Kontraktion von Kaninchenskelettmuskelfasern, die mit 50% Glycerin extrahiert wurden, durch Zugabe von Adenosintriphosphat (ATP)1. Dieses Experiment war das erste, das bewies, dass ATP die Muskelkontraktion mit Energie versorgt. Die Methodik wurde bald auf die Untersuchung von ATP-energetisierter Ziliar- / Flagellenmotilität angewendet, wie Spermienflagellen2, Paramecium cilia 3 und Chlamydomonas reinhardtii cilia (auch Flagellen genannt)4 unter Verwendung von nichtionischen Reinigungsmitteln zur Demembranation.
Die einzellige Grünalge C. reinhardtii ist ein Modellorganismus für die Erforschung von Zilien: Sie schwimmt mit zwei Zilien, indem sie sie wie die Brust eines Menschen schlägt5. Die Ziliarbewegung wird durch Dynein angetrieben, ein minus-end-gerichtetes Mikrotubuli-basiertes Motorprotein 6,7. Ziliare Dyneine können in Außenarm-Dynes und Innenarm-Dynein eingeteilt werden. Mutanten, denen jede Art von Dynein fehlt, wurden als langsam schwimmende Mutanten mit unterschiedlichen Motilitätsanomalien isoliert. Die detaillierte In-vitro-Motilitätsanalyse dieser Mutanten hat die Dynein-Forschung erheblich vorangebracht8.
Seit der Etablierung des In-vitro-Reaktivierungsexperiments von demembranierten C. reinhardtii-Zellen (Zellmodelle) wurden mit dieser Methode und ihren Derivaten viele wichtige Erkenntnisse erzielt. Die Reaktivierung von Zellmodellen in einer Reihe von Ca2+-Puffern zeigtebeispielsweise 9, dass zwei Zilien durch submikromolare Ca2+ unterschiedlich reguliert werden, und diese asymmetrische Zilienkontrolle ermöglicht die phototaktische Orientierung von C. reinhardtii10. Darüber hinaus zeigen beide Zilien eine Wellenformkonvertierung vom Vorwärtsschwimmmodus (asymmetrische Wellenform genannt) in den Rückwärtsschwimmmodus (symmetrische Wellenform genannt, die für einen kurzen Zeitraum auftritt, wenn Zellen photo- oder mechanoschockiert sind)11,12. Diese Wellenformumwandlung wird durch submillimolare Ca2+ reguliert, was durch die Reaktivierung des sogenannten Nukleoflagellarapparates (ein Komplex mit zwei Zilien, den Basalkörpern, den Strukturen, die die Basalkörper mit dem Kern verbinden, und dem Rest des Kerns)11 oder demembranierten Axonemen isolierter Zilien13 gezeigt wurde. Abgesehen von Ca2 + ist die Redox-Haltung (Reduktions-Oxidation) ein Signal, das die Ziliarschlagfrequenz reguliert, was durch die Reaktivierung von Zellmodellen in Redoxpuffern gezeigt wurde, die unterschiedliche Verhältnisse von reduziertem Glutathion zu oxidiertem Glutathion 14 enthalten. Darüber hinaus reguliert cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) asymmetrisch zwei Zilien, was durch die Reaktivierung von Axonemen mit photoklavierbarem cAMP15 gezeigt wurde. Diese In-vitro-Befunde, kombiniert mit genetischen Befunden, haben zu einem tieferen Verständnis der molekularen Mechanismen der Zilienregulation bei C. reinhardtii geführt.
Ein Protokoll zur Reaktivierung der Zellmodelle wird hier beschrieben. Die Methode ist einfach, ermöglicht verschiedene Modifikationen und kann auf mehrere Organismen angewendet werden, die sich mit Zilien bewegen. Da demembranierte Zellen jedoch zerbrechlich sind, sind einige Tipps erforderlich, um die Motilität von Zellmodellen mit guter Effizienz zu reaktivieren und gleichzeitig eine Dezitilisierung zu verhindern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt zwei kritische Schritte in diesem Protokoll. Der erste ist ein Prozess, der als Demembranation bekannt ist und sanft, aber gründlich durchgeführt werden muss. Die Deziliation (d.h. das Ablösen von Zilien vom Zellkörper) wird durch kräftiges Pipettieren oder Wirbeln induziert, wodurch die Zellmodelle auch nach der Zugabe von ATP unbeweglich werden. Typischerweise sind 5 × 107 Zellen in ~0,5 ml Demembranationspuffer suspendiert (Endzelldichte: 1 × 108 Zellen/ml). Die Reaktivierungsrate …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch Zuschüsse der Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) an N.U. (19K23758, 21K06295) und K.W. (19H03242, 20K21420, 21H00420), von der Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) an K.W. und von der Dynamic Alliance for Open Innovation Bridging Human, Environment and Materials (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) an N.U. und K.W. unterstützt. Wir danken Frau Miyuki Shinohara (Hosei Univ.) für ihre Hilfe bei der Vorbereitung der Figuren.
Materials
| 0.5 mL plastic tube | QSP | 502-PLN-Q | |
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sima-Aldrich | A2383 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strain CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| Creatine kinase | Merck | CK-RO | |
| Creatine phosphate | Merck | CRPHO-RO | |
| Dithiothreitol (DTT) | Nakalai tesque | 14128-46 | |
| GEDTA(EGTA) | Dojindo | G002 | |
| Hepes | Dojindo | GB70 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich. |
| MgSO4-7H2O | Nakalai tesque | 21002-85 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Pasteur pipette | fisher scientific | 13-678-20C | |
| Polyethylene glycol, Mr 20,000 | Merck | 8.18897.1000 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Sodium Hydroxide | Nacalai | 31511-05 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
Riferimenti
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