Chlamydomonas reinhardtii'de Demembrane Hücre Modellerinin Reaktivasyonu
Summary
Hareketli hücrelerin in vitro reaktivasyonu, hücre hareketliliğinin mekanizmalarını anlamada çok önemli bir deneydir. Protokol, kirpikler / flagella’yı incelemek için bir model organizma olan Chlamydomonas reinhardtii’nin demembrane edilmiş hücre modellerinin yeniden aktive edilmesini açıklar.
Abstract
Szent-Györgyi’nin 20. yüzyılın ortalarında gösterdiği ATP eklenerek gliserinli kasın kasılmasına ilişkin tarihsel deneyden bu yana, demembrane hücrelerin in vitro reaktivasyonu, hücre hareketliliğini incelemek için geleneksel ve güçlü bir yol olmuştur. Bu deneysel yöntemin temel avantajı, reaktivasyon çözeltisinin bileşiminin kolayca değiştirilebilmesidir. Örneğin, in vivo membran uyarımı nedeniyle sadece geçici olarak meydana gelen yüksek Ca2+ konsantrasyon ortamı laboratuvarda çoğaltılabilir. Ökaryotik kirpikler (diğer adıyla flagella), düzenleyici mekanizmaları hala açıklığa kavuşturulması gereken ayrıntılı hareketlilik makineleridir. Tek hücreli yeşil alg Chlamydomonas reinhardtii, kirpiklerin araştırma alanında mükemmel bir model organizmadır. C. reinhardtii’nin demembrane hücre modellerini ve izole kirpiklerin demembrane aksonemleri gibi türevlerini kullanan reaktivasyon deneyleri, siliyer motilitenin moleküler mekanizmalarının anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Bu deneyler, ATP’nin siliyer hareketliliğe enerji verdiğini ve Ca2 +, cAMP ve reaktif oksijen türleri de dahil olmak üzere çeşitli hücresel sinyallerin siliyer hareketleri modüle ettiğini açıklığa kavuşturdu. C. reinhardtii hücrelerinin demembranasyonu ve hücre modellerinin reaktivasyonu için kesin yöntem burada açıklanmıştır.
Introduction
Hatırlanan hareketli hücrelerin in vitro reaktivasyonu, hücre hareketliliğinin düzenleyici mekanizmasının moleküler temelini incelemek için değerli bir araçtır. Szent-Györgyi ilk olarak adenozin trifosfat (ATP) ekleyerek %50 gliserol ile ekstrakte edilen tavşan iskelet kası liflerinin in vitro kasılmasını gösterdi1. Bu deney, ATP’nin kas kasılmasına enerji verdiğini kanıtlayan ilk deneydi. Metodoloji kısa bir süre sonra, sperm flagella2, Paramecium cilia3 ve Chlamydomonas reinhardtii cilia (flagella olarak da adlandırılır)4 gibi ATP enerjili siliyer / flagellar motilitenin incelenmesine, demembranasyon için iyonik olmayan deterjanlar kullanılarak uygulandı.
Tek hücreli yeşil alg C. reinhardtii, kirpikleri incelemek için model bir organizmadır: iki kirpikle yüzerek onları bir insanın kurbağalaması gibi döver5. Siliyer hareket, eksi uçlu yönlendirilmiş mikrotübül bazlı bir motor protein 6,7 olan dynein tarafından tahrik edilir. Siliyer dinyenler dış kol dineinleri ve iç kol dineinleri olarak sınıflandırılabilir. Her türlü dineinden yoksun mutantlar, farklı hareketlilik anormalliklerine sahip yavaş yüzen mutantlar olarak izole edilmiştir. Bu mutantların ayrıntılı in vitro motilite analizi, dinein araştırmalarını önemli ölçüde ilerletmiştir8.
Hatırlanan C. reinhardtii hücrelerinin (hücre modelleri) in vitro reaktivasyon deneyi kurulduğundan beri bu yöntem ve türevleri kullanılarak birçok önemli bulguya ulaşılmıştır. Örneğin, bir dizi Ca 2 + tamponunda hücre modellerinin reaktivasyonu,9’a iki kirpiklerin submikromolar Ca2 + tarafından farklı şekilde düzenlendiğini gösterdi ve bu asimetrik kirpik kontrolü, C. reinhardtii10’un fototaktik yönelimini sağlar. Ayrıca, her iki kirpik de ileri yüzme modundan (asimetrik dalga formu olarak adlandırılır) geriye doğru yüzme moduna (hücreler foto veya mekano-şok edildiğinde kısa bir süre için ortaya çıkan simetrik dalga formu olarak adlandırılır) dalga formu dönüşümü gösterir11,12. Bu dalga formu dönüşümü, nükleoflagellar aparatın (iki kirpik, bazal cisimler, bazal cisimleri çekirdeğe bağlayan yapılar ve çekirdeğin kalıntılarını içeren bir kompleks)11 veya izole kirpiklerin demembrane edilmiş aksonemlerinin reaktivasyonu ile gösterilen submilimolar Ca2 + ile düzenlenir13. Ca2+ dışında, redoks (indirgeme-oksidasyon) duruşu, indirgenmiş glutatyon ve oksitlenmiş glutatyon14’ün farklı oranlarını içeren redoks tamponlarındaki hücre modellerinin reaktivasyonu ile gösterilen siliyer atma frekansını düzenleyen bir sinyaldir. Ek olarak, siklik adenozin monofosfat (cAMP), fotobölünebilir kafesli cAMP15 ile aksonemlerin reaktivasyonu ile gösterilen iki kirpikleri asimetrik olarak düzenler. Bu in vitro bulgular, genetik bulgularla birleştiğinde, C. reinhardtii’deki kirpik regülasyonunun moleküler mekanizmalarının daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlamıştır.
Hücre modellerini yeniden etkinleştirmek için bir protokol burada açıklanmıştır. Yöntem basittir, çeşitli modifikasyonlara izin verir ve kirpiklerle hareket eden birden fazla organizmaya uygulanabilir. Bununla birlikte, demembrane edilmiş hücreler kırılgan olduğundan, hücre modellerinin hareketliliğini iyi bir verimlilikle yeniden etkinleştirmek için bazı ipuçları gerektirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde iki kritik adım vardır. Birincisi, nazikçe ama iyice yapılması gereken demembranasyon olarak bilinen bir işlemdir. Dekiliasyon (yani, kirpiklerin hücre gövdesinden ayrılması), güçlü pipetleme veya vorteks ile indüklenir ve hücre modellerini ATP’nin eklenmesinden sonra bile hareketsiz hale getirir. Tipik olarak, 5 × 107 hücre, ~ 0.5 mL demembranasyon tamponunda askıya alınır (son hücre yoğunluğu: 1 × 108 hücre / mL). Hücre modeli yoğunluğu bundan çok daha d?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Japonya Bilimi Geliştirme Derneği KAKENHI’den (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) N.U. (19K23758, 21K06295) ve K.W.’ye (19H03242, 20K21420, 21H00420), Ohsumi Frontier Science Foundation’dan (https://www.ofsf.or.jp/en/) K.W.’ye ve İnsan, Çevre ve Malzeme Köprüsü için Dinamik İttifak’tan (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) N.U. ve K.W.’ye hibelerle desteklenmiştir. Bayan Miyuki Shinohara’ya (Hosei Univ.) figürlerin hazırlanmasındaki yardımı için teşekkür ederiz.
Materials
| 0.5 mL plastic tube | QSP | 502-PLN-Q | |
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sima-Aldrich | A2383 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strain CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| Creatine kinase | Merck | CK-RO | |
| Creatine phosphate | Merck | CRPHO-RO | |
| Dithiothreitol (DTT) | Nakalai tesque | 14128-46 | |
| GEDTA(EGTA) | Dojindo | G002 | |
| Hepes | Dojindo | GB70 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 | IUPAC name is octylphenoxypolyethoxyethanol: IGEPAL CA-630 is a substitute for Nonidet P-40 (NP-40); NP-40 is no longer available in Sigma-Aldrich. |
| MgSO4-7H2O | Nakalai tesque | 21002-85 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Pasteur pipette | fisher scientific | 13-678-20C | |
| Polyethylene glycol, Mr 20,000 | Merck | 8.18897.1000 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Sodium Hydroxide | Nacalai | 31511-05 | |
| Sucrose | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 196-00015 |
Riferimenti
- Szent-Gyorgyi, A. Free-energy relations and contraction of actomyosin. Biological Bulletin. 96 (2), 140-161 (1949).
- Hoffman-Berling, H. Adenosintriphosphat als betriebsstoff von zellbewegungen. Biochimica et Biophysica Acta. 14, 182-194 (1954).
- Naitoh, Y., Kaneko, H. Reactivated Triton-extracted models of Paramecium: modification of ciliary movement by calcium ions. Science. 176 (4034), 523-524 (1972).
- Witman, G. B., Plummer, J., Sander, G. Chlamydomonas flagellar mutants lacking radial spokes and central tubules. Structure, composition, and function of specific axonemal components. Journal of Cell Biology. 76 (3), 729-747 (1978).
- Rüffer, U., Nultsch, W. Flagellar coordination in Chlamydomonas cells held on micropipettes. Cell Motility and the Cytoskeleton. 41 (4), 297-307 (1998).
- Sale, W. S., Satir, P. Direction of active sliding of microtubules in Tetrahymena cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (5), 2045-2049 (1977).
- Fox, L. A., Sale, W. S. Direction of force generated by the inner row of dynein arms on flagellar microtubules. Journal of Cell Biology. 105 (4), 1781-1787 (1987).
- Kamiya, R., Yagi, T. Functional diversity of axonemal dyneins as assessed by in vitro and in vivo motility assays of Chlamydomonas mutants. Zoolog Science. 31 (10), 633-644 (2014).
- Kamiya, R., Witman, G. B. Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).
- Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. Phototactic activity in Chlamydomonas ‘non-phototactic’ mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein. Journal of Cell Science. 118, 529-537 (2005).
- Hyams, J. S., Borisy, G. G. Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro. Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).
- Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion. Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).
- Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).
- Wakabayashi, K., King, S. M. Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise. Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).
- Saegusa, Y., Yoshimura, K. cAMP controls the balance of the propulsive forces generated by the two flagella of Chlamydomonas. Cytoskeleton. 72 (8), 412-421 (2015).
- Gorman, D. S., Levine, R. P. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).
- Takano, W., Hisabori, T., Wakabayashi, K. Rapid estimation of cytosolic ATP concentration from the ciliary beating frequency in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Journal of Biological Chemistry. 296, 100156 (2021).
- Wakabayashi, K., Yagi, T., Kamiya, R. Ca2+-dependent waveform conversion in the flagellar axoneme of Chlamydomonas mutants lacking the central-pair/radial spoke system. Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (1), 22-28 (1997).
- Yueh, Y. G., Crain, R. C. Deflagellation of Chlamydomonas reinhardtii follows a rapid transitory accumulation of inositol 1,4,5-trisphosphate and requires Ca2+ entry. Journal of Cell Biology. 123 (4), 869-875 (1993).
- Wakabayashi, K., Ide, T., Kamiya, R. Calcium-dependent flagellar motility activation in Chlamydomonas reinhardtii in response to mechanical agitation. Cell Motility and the Cytoskeleton. 66 (9), 736-742 (2009).
- Ueki, N., Wakabayashi, K. Detergent-extracted Volvox model exhibits an anterior-posterior gradient in flagellar Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1061-1068 (2018).
- Tanno, A., et al. The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability. PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).
