원자력 현미경을 사용한 살아있는 식물 장기의 일차 세포벽의 기계적 특성 특성 분석
Summary
세포벽 생체 역학에 대한 연구는 식물 성장과 형태 형성을 이해하는 데 필수적입니다. 다음 프로토콜은 원자력 현미경을 사용하여 젊은 식물 기관의 내부 조직에서 얇은 1 차 세포벽을 조사하기 위해 제안됩니다.
Abstract
일차 세포벽의 기계적 특성은 식물 세포 성장의 방향과 속도를 결정하므로 식물의 미래 크기와 모양을 결정합니다. 이러한 특성을 측정하기 위해 많은 정교한 기술이 개발되었습니다. 그러나 원자력 현미경 (AFM)은 세포 수준에서 세포벽 탄성을 연구하는 데 가장 편리합니다. 이 기술의 가장 중요한 한계 중 하나는 표면 또는 분리 된 살아있는 세포 만 연구 할 수 있다는 것입니다. 여기에서는 식물체의 내부 조직에 속하는 일차 세포벽의 기계적 특성을 조사하기 위해 원자력 현미경을 사용합니다. 이 프로토콜은 뿌리의 세포벽의 명백한 영률 측정을 설명하지만이 방법은 다른 식물 기관에도 적용될 수 있습니다. 측정은 액체 셀에서 식물 재료의 비브라톰 유래 절편에서 수행되므로 (i) 플라즈마 분해 용액의 사용 또는 왁스 또는 수지 샘플 함침을 피하고 (ii) 실험을 빠르게 수행하며 (iii) 샘플의 탈수를 방지 할 수 있습니다. 항음핵 세포벽과 주위 세포벽 모두 표본이 어떻게 절편되었는지에 따라 연구할 수 있습니다. 다른 조직의 기계적 특성의 차이는 단일 섹션에서 조사 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 연구 계획의 원리, 시편 준비 및 측정 문제, 얻은 탄성 계수 값에 대한 지형의 영향을 피하기 위해 힘 변형 곡선을 선택하는 방법을 설명합니다. 상기 방법은 샘플 크기에 의해 제한되지 않지만, 세포 크기에 민감하다(즉, 큰 내강을 갖는 세포는 검사하기 어렵다).
Introduction
식물 세포벽의 기계적 성질은 세포의 모양과 성장 능력을 결정합니다. 예를 들어, 꽃가루 튜브의 성장 팁은 동일한 튜브1의 성장하지 않는 부분보다 부드럽습니다. Arabidopsis 분열 조직의 원시 형성은 미래의 원시 2,3 부위에서 세포벽 강성의 국부적 감소가 선행됩니다. 주 성장 축과 평행하고 더 빨리 성장하는 Arabidopsis 배축의 세포벽은이 축에 수직이고 느리게 성장하는 세포벽보다 부드럽습니다 4,5. 옥수수 뿌리에서 분열에서 신장으로의 세포 전이는 뿌리의 모든 조직에서 탄성 계수의 감소를 동반했다. 탄성률은 연신율 영역에서 낮게 유지되었고 후기 신장 영역6에서 증가했습니다.
다양한 방법의 가용성에도 불구하고, 매년 얻어지는 세포벽 생물학에 대한 생화학 적 및 유전 적 정보의 큰 배열은 세포벽의 기계적 특성과 거의 비교되지 않습니다. 예를 들어, 세포벽 관련 유전자의 돌연변이는 종종 성장 및 발달을 변경했지만 4,7,8 생체 역학 측면에서 거의 설명되지 않습니다. 그 이유 중 하나는 세포 및 세포 수준에서 측정을 수행하기가 어렵 기 때문입니다. 원자력 현미경 (AFM)은 현재 이러한 분석을위한 주요 접근법입니다9.
최근 몇 년 동안 식물 세포벽 생체 역학에 대한 수많은 AFM 기반 연구가 수행되었습니다. Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 및 양파 12의 외부 조직의 세포벽과 배양 된 세포13,14,15의 기계적 특성이 조사 되었습니다. 그러나, 식물의 표면 세포는 내부 조직6의 기계적 성질과 상이한 세포벽을 가질 수있다. 또한 식물 세포는 팽창에 의해 가압되어 더 뻣뻣 해집니다. 팽창 압력의 영향을 제거하기 위해 연구자들은 플라즈마 분해 용액 2,3,4,5,10,11 을 사용하거나 얻은 값을 팽창 및 세포 벽 기여 12로 분해해야합니다. 제 1 접근법은 샘플 탈수로 이어지고 세포벽(16)의 두께 및 특성을 변화시키는 반면, 제 2 접근법은 추가적인 측정 및 복잡한 수학을 필요로 하며, 비교적 단순한 형상(12)의 세포에만 적용된다. 내부 조직의 세포벽 특성은 냉동 절편17 또는 수지8이 함침 된 식물 재료의 절편에서 평가할 수 있습니다. 그러나 두 방법 모두 샘플의 탈수 및/또는 함침을 포함하며, 이는 필연적으로 특성의 변화로 이어집니다. 분리되거나 배양 된 세포의 특성은 전체 식물의 생리학과 관련되기가 어렵습니다. 식물 세포의 배양과 분리는 모두 세포벽의 기계적 특성에 영향을 줄 수 있습니다.
여기에 제시된 방법은 앞서 언급 한 접근 방식을 보완합니다. 이를 사용하여 모든 조직의 기본 세포벽과 식물 발달의 모든 단계를 검사 할 수 있습니다. 절편 및 AFM 관찰은 샘플 탈수를 피하는 액체에서 수행되었습니다. 팽창의 문제는 세포가 절단됨에 따라 해결되었습니다. 이 프로토콜은 옥수수와 호밀 뿌리에 대한 작업을 설명하지만 다른 샘플은 비브라톰 절단에 적합한 경우 검사 할 수 있습니다.
여기에 설명 된 AFM 연구는 힘-부피 기술을 사용하여 수행되었습니다. 악기마다 이 메서드에 대해 다른 이름을 사용합니다. 그러나 기본 원칙은 동일합니다. 샘플의 힘-체적 맵은 캔틸레버 편향(18)을 기록하면서 각각의 분석된 지점에서 특정 하중을 달성하기 위해 캔틸레버(또는 샘플)의 정현파 또는 삼각형 운동에 의해 얻어진다. 결과는 표면의 지형 이미지와 힘-거리 곡선의 배열을 결합합니다. 각 곡선은 특정 지점에서의 변형, 강성, 영률, 접착력 및 에너지 소산을 계산하는 데 사용됩니다. 유사한 데이터는 접촉 모드19에서 스캐닝 한 후 점별 힘 분광법에 의해 얻어 질 수 있지만, 더 많은 시간이 소요된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
1 차 세포벽의 기계적 특성은 식물 세포 성장의 방향과 속도를 결정하므로 식물의 미래 크기와 모양을 결정합니다. 여기에 제시된 AFM 기반 방법은 식물 세포벽의 특성을 연구하는 데 사용되는 기존 기술을 보완합니다. 그것은 식물의 내부 조직에 속하는 세포벽의 탄력성을 조사 할 수있게합니다. 제시된 방법을 사용하여, 성장하는 옥수수 뿌리의 상이한 조직에서의 세포벽의 기계적 성질을 매핑?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
옥수수와 호밀 씨앗을 각각 제공한 드미트리 수슬로프 박사(러시아 상트페테르부르크 상트페테르부르크 주립대학교)와 미라 포노마레바 교수(타타르 농업 연구소, FRC KazSC RAS, 카잔, 러시아)에게 감사를 표합니다. 제시된 방법은 LK에 수여 된 러시아 과학 재단 프로젝트 번호 18-14-00168의 틀 내에서 개발되었습니다. 작업의 일부 (제시된 결과 획득)는 RAS의 FRC 카잔 과학 센터에 대한 정부 할당의 재정 지원으로 AP에 의해 수행되었습니다.
Materials
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | – | – | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | – | – | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | – | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | – | – | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | – | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | – | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | – |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | – |
| Ultrapure water | – | – | – |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
Riferimenti
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