Charakterisierung mechanischer Eigenschaften der primären Zellwand in lebenden Pflanzenorganen mittels Rasterkraftmikroskopie
Summary
Studien der Zellwandbiomechanik sind essentiell für das Verständnis des Pflanzenwachstums und der Morphogenese. Das folgende Protokoll wird vorgeschlagen, um dünne primäre Zellwände in den inneren Geweben junger Pflanzenorgane mittels Rasterkraftmikroskopie zu untersuchen.
Abstract
Die mechanischen Eigenschaften der primären Zellwände bestimmen die Richtung und Geschwindigkeit des Pflanzenzellwachstums und damit die zukünftige Größe und Form der Pflanze. Viele ausgeklügelte Techniken wurden entwickelt, um diese Eigenschaften zu messen; Die Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist jedoch nach wie vor am besten geeignet, um die Elastizität der Zellwand auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Eine der wichtigsten Einschränkungen dieser Technik war, dass nur oberflächliche oder isolierte lebende Zellen untersucht werden können. Hier wird die Verwendung der Rasterkraftmikroskopie zur Untersuchung der mechanischen Eigenschaften von primären Zellwänden vorgestellt, die zu den inneren Geweben eines Pflanzenkörpers gehören. Dieses Protokoll beschreibt Messungen des scheinbaren Elastizitätsmoduls von Zellwänden in Wurzeln, aber die Methode kann auch auf andere Pflanzenorgane angewendet werden. Die Messungen werden an vibratom-abgeleiteten Abschnitten von Pflanzenmaterial in einer flüssigen Zelle durchgeführt, was (i) die Verwendung von Plasmolyselösungen oder Probenimprägnierung mit Wachs oder Harz vermeidet, (ii) die Experimente schnell macht und (iii) eine Austrocknung der Probe verhindert. Je nachdem, wie die Probe geschnitten wurde, können sowohl antiklinale als auch periklinale Zellwände untersucht werden. Unterschiede in den mechanischen Eigenschaften verschiedener Gewebe können in einem einzigen Abschnitt untersucht werden. Das Protokoll beschreibt die Prinzipien der Studienplanung, Probleme bei der Probenvorbereitung und den Messungen sowie die Methode zur Auswahl von Kraft-Verformungskurven, um den Einfluss der Topographie auf die erhaltenen Werte des Elastizitätsmoduls zu vermeiden. Die Methode ist nicht durch die Stichprobengröße begrenzt, sondern empfindlich gegenüber der Zellgröße (dh Zellen mit einem großen Lumen sind schwer zu untersuchen).
Introduction
Die mechanischen Eigenschaften der pflanzlichen Zellwand bestimmen die Form der Zelle und ihre Wachstumsfähigkeit. Zum Beispiel ist die wachsende Spitze des Pollenschlauches weicher als die nicht wachsenden Teile derselben Röhre1. Der Primordia-Bildung auf Arabidopsis meristem geht eine lokale Abnahme der Zellwandsteifigkeit an der Stelle des zukünftigen Primordiums 2,3 voraus. Die Zellwände von Arabidopsis hypocotyl, die parallel zur Hauptwachstumsachse verlaufen und schneller wachsen, sind weicher als diejenigen, die senkrecht zu dieser Achse stehen und langsamer wachsen 4,5. In der Maiswurzel ging der Übergang der Zellen von der Teilung zur Dehnung mit einer Abnahme der Elastizitätsmodule in allen Geweben der Wurzel einher. Die Module blieben in der Dehnungszone niedrig und nahmen in der späten Dehnungszone6 zu.
Trotz der Verfügbarkeit verschiedener Methoden werden die großen biochemischen und genetischen Informationen zur Zellwandbiologie, die jährlich gewonnen werden, selten mit den mechanischen Eigenschaften der Zellwände verglichen. Zum Beispiel haben Mutanten auf Zellwand-verwandten Genen oft verändertes Wachstum und Entwicklung 4,7,8, werden aber selten biomechanisch beschrieben. Einer der Gründe dafür ist die Schwierigkeit, Messungen auf zellulärer und subzellulärer Ebene durchzuführen. Die Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist derzeit der primäre Ansatz für solche Analysen9.
In den letzten Jahren wurden zahlreiche AFM-basierte Studien zur Biomechanik pflanzlicher Zellwände durchgeführt. Die mechanischen Eigenschaften der Zellwände der äußeren Gewebe von Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 und Zwiebel 12 sowie von kultivierten Zellen 13,14,15 wurden untersucht. Die oberflächlichen Zellen einer Pflanze können jedoch Zellwände aufweisen, deren mechanische Eigenschaften sich von denen der inneren Gewebe unterscheiden6. Darüber hinaus werden Pflanzenzellen durch Turgor unter Druck gesetzt, was sie steifer macht. Um den Einfluss des Turgordrucks loszuwerden, müssen die Forscher Plasmolyselösungen 2,3,4,5,10,11 verwenden oder die erhaltenen Werte in Turgor- und Zellwandbeiträgezerlegen 12. Der erste Ansatz führt zur Dehydratisierung der Probe und verändert die Dicke und Eigenschaften der Zellwand16, während der zweite Ansatz zusätzliche Messungen und komplizierte Mathematik erfordert und nur für Zellen der relativ einfachen Form12 gilt. Die Zellwandeigenschaften von inneren Geweben können an Kryosektionen17 oder mitHarz 8 imprägnierten Pflanzenmaterialabschnitten bewertet werden. Beide Methoden beinhalten jedoch eine Dehydratisierung und/oder Imprägnierung von Proben, was unweigerlich zu Veränderungen der Eigenschaften führt. Die Eigenschaften isolierter oder kultivierter Zellen lassen sich schwer mit der Physiologie der gesamten Pflanze in Verbindung bringen. Sowohl die Kultivierung als auch die Isolierung von Pflanzenzellen können die mechanischen Eigenschaften ihrer Zellwände beeinflussen.
Die hier vorgestellte Methode ergänzt die oben genannten Ansätze. Damit können die primären Zellwände jedes Gewebes und in jedem Stadium der Pflanzenentwicklung untersucht werden. Schnitt- und AFM-Beobachtungen wurden in Flüssigkeit durchgeführt, wodurch eine Austrocknung der Probe vermieden wird. Das Problem des Turgors wurde gelöst, wenn die Zellen geschnitten werden. Das Protokoll beschreibt die Arbeit mit Mais- und Roggenwurzeln, aber jede andere Probe kann untersucht werden, ob sie für das Schneiden von Vibratomen geeignet ist.
Die hier beschriebenen AFM-Studien wurden mit der Kraft-Volumen-Technik durchgeführt. Verschiedene Instrumente verwenden unterschiedliche Namen für diese Methode. Das Grundprinzip ist jedoch dasselbe; Eine Kraft-Volumen-Karte der Probe wird durch eine sinusförmige oder dreieckige Bewegung des Cantilevers (oder der Probe) erhalten, um an jedem analysierten Punkt eine bestimmte Belastungskraft zu erreichen, während die Cantilever-Auslenkung18 aufgezeichnet wird. Das Ergebnis kombiniert ein topographisches Bild der Oberfläche und die Anordnung von Kraft-Weg-Kurven. Jede Kurve wird verwendet, um die Verformung, Steifigkeit, Elastizitätsmodul, Adhäsion und Energiedissipation an einem bestimmten Punkt zu berechnen. Ähnliche Daten können durch Punkt-für-Punkt-Kraftspektroskopie nach dem Scannen im Kontaktmodus19 gewonnen werden, obwohl dies zeitaufwendiger ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die mechanischen Eigenschaften der primären Zellwände bestimmen die Richtung und Geschwindigkeit des Pflanzenzellwachstums und damit die zukünftige Größe und Form der Pflanze. Die hier vorgestellte AFM-basierte Methode ergänzt bestehende Techniken, mit denen die Eigenschaften pflanzlicher Zellwände untersucht werden. Es ermöglicht es, die Elastizität von Zellwänden zu untersuchen, die zu den inneren Geweben der Pflanze gehören. Mit der vorgestellten Methode wurden die mechanischen Eigenschaften von Zellwänden…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Dmitry Suslov (Staatliche Universität Sankt Petersburg, Sankt Petersburg, Russland) und Prof. Mira Ponomareva (Tatar Scientific Research Institute of Agriculture, FRC KazSC RAS, Kazan, Russland) für die Bereitstellung von Maissaatgut bzw. Roggensaatgut. Die vorgestellte Methode wurde im Rahmen des an LK vergebenen Projekts der Russian Science Foundation Nr. 18-14-00168 entwickelt. Der Teil der Arbeit (Einholung der vorgestellten Ergebnisse) wurde von AP mit finanzieller Unterstützung des Regierungsauftrags für das FRC Kazan Scientific Center der RAS durchgeführt.
Materials
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | – | – | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | – | – | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | – | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | – | – | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | – | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | – | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | – |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | – |
| Ultrapure water | – | – | – |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
Riferimenti
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