Caracterización de las propiedades mecánicas de la pared celular primaria en órganos vegetales vivos mediante microscopía de fuerza atómica
Summary
Los estudios de biomecánica de la pared celular son esenciales para comprender el crecimiento y la morfogénesis de las plantas. Se propone el siguiente protocolo para investigar las paredes celulares primarias delgadas en los tejidos internos de órganos de plantas jóvenes utilizando microscopía de fuerza atómica.
Abstract
Las propiedades mecánicas de las paredes celulares primarias determinan la dirección y la tasa de crecimiento de las células vegetales y, por lo tanto, el tamaño y la forma futuros de la planta. Se han desarrollado muchas técnicas sofisticadas para medir estas propiedades; sin embargo, la microscopía de fuerza atómica (AFM) sigue siendo la más conveniente para estudiar la elasticidad de la pared celular a nivel celular. Una de las limitaciones más importantes de esta técnica ha sido que solo se pueden estudiar células vivas superficiales o aisladas. Aquí se presenta el uso de la microscopía de fuerza atómica para investigar las propiedades mecánicas de las paredes celulares primarias pertenecientes a los tejidos internos del cuerpo vegetal. Este protocolo describe las mediciones del módulo aparente de Young de las paredes celulares en las raíces, pero el método también se puede aplicar a otros órganos de la planta. Las mediciones se realizan en secciones de material vegetal derivadas de vibratomas en una celda líquida, lo que permite (i) evitar el uso de soluciones plasmolizantes o impregnación de muestras con cera o resina, (ii) hacer que los experimentos sean rápidos y (iii) prevenir la deshidratación de la muestra. Se pueden estudiar tanto las paredes celulares anticlinales como las periclinas, dependiendo de cómo se seccionó la muestra. Las diferencias en las propiedades mecánicas de diferentes tejidos se pueden investigar en una sola sección. El protocolo describe los principios de planificación del estudio, los problemas con la preparación y las mediciones de la muestra, así como el método de selección de curvas de fuerza-deformación para evitar la influencia de la topografía en los valores obtenidos del módulo elástico. El método no está limitado por el tamaño de la muestra, pero es sensible al tamaño de la célula (es decir, las células con una gran luz son difíciles de examinar).
Introduction
Las propiedades mecánicas de la pared celular de la planta determinan la forma de la célula y su capacidad para crecer. Por ejemplo, la punta en crecimiento del tubo polínico es más suave que las partes que no crecen del mismo tubo1. La formación de primordios en el meristemo de Arabidopsis está precedida por una disminución local de la rigidez de la pared celular en el sitio del futuro primordio 2,3. Las paredes celulares de Arabidopsis hypocotyl, que son paralelas al eje de crecimiento principal y crecen más rápido, son más suaves que las que son perpendiculares a este eje y crecen más lentamente 4,5. En la raíz de maíz, la transición de las células de la división al alargamiento se acompañó de una disminución de los módulos elásticos en todos los tejidos de la raíz. Los módulos se mantuvieron bajos en la zona de elongación y aumentaron en la zona de elongación tardía6.
A pesar de la disponibilidad de varios métodos, las grandes cantidades de información bioquímica y genética sobre la biología de la pared celular obtenida anualmente rara vez se comparan con las propiedades mecánicas de las paredes celulares. Por ejemplo, los mutantes en genes relacionados con la pared celular a menudo tienen un crecimiento y desarrollo alterados 4,7,8, pero rara vez se describen en términos de biomecánica. Una de las razones de esto es la dificultad de realizar mediciones a nivel celular y subcelular. La microscopía de fuerza atómica (AFM) es actualmente el enfoque principal para tales análisis9.
En los últimos años, se han llevado a cabo numerosos estudios basados en AFM sobre biomecánica de la pared celular vegetal. Se han investigado las propiedades mecánicas de las paredes celulares de los tejidos externos de Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 y cebolla 12, así como de células cultivadas 13,14,15. Sin embargo, las células superficiales de una planta pueden tener paredes celulares cuyas propiedades mecánicas difieren de las de los tejidos internos6. Además, las células vegetales son presurizadas por turgencia, lo que las hace más rígidas. Para deshacerse de la influencia de la presión de turgencia, los investigadores tienen que utilizar soluciones plasmolizantes 2,3,4,5,10,11 o descomponer los valores obtenidos en turgencia y aportes de pared celular 12. El primer enfoque conduce a la deshidratación de la muestra y cambia el grosor y las propiedades de la pared celular16, mientras que el segundo enfoque requiere mediciones adicionales y matemáticas complicadas, y se aplica solo a células de forma relativamente simple12. Las propiedades de la pared celular de los tejidos internos pueden evaluarse en criosecciones17 o secciones de material vegetal impregnado con resina8. Sin embargo, ambos métodos implican deshidratación y/o impregnación de muestras, lo que inevitablemente conduce a cambios en las propiedades. Las propiedades de las células aisladas o cultivadas son difíciles de relacionar con la fisiología de toda la planta. Tanto el cultivo como el aislamiento de las células vegetales pueden afectar las propiedades mecánicas de sus paredes celulares.
El método presentado aquí complementa los enfoques antes mencionados. Usándolo, se pueden examinar las paredes celulares primarias de cualquier tejido y en cualquier etapa del desarrollo de la planta. Las observaciones de seccionamiento y AFM se realizaron en líquido, lo que evita la deshidratación de la muestra. El problema de la turgencia se resolvió a medida que se cortan las células. El protocolo describe el trabajo con raíces de maíz y centeno, pero cualquier otra muestra puede ser examinada si es adecuada para la sección de vibratomo.
Los estudios de MFA descritos aquí se realizaron utilizando la técnica de fuerza-volumen. Diferentes instrumentos usan diferentes nombres para este método. Sin embargo, el principio básico es el mismo; Un mapa fuerza-volumen de la muestra se obtiene mediante un movimiento sinusoidal o triangular del voladizo (o muestra) para lograr una cierta fuerza de carga en cada punto analizado, mientras se registra la deflexión del voladizo18. El resultado combina una imagen topográfica de la superficie y la matriz de curvas fuerza-distancia. Cada curva se utiliza para calcular la deformación, rigidez, módulo de Young, adhesión y disipación de energía en un punto específico. Se pueden obtener datos similares por espectroscopia de fuerza punto por punto después de escanear en el modode contacto 19, aunque lleva más tiempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las propiedades mecánicas de las paredes celulares primarias determinan la dirección y la tasa de crecimiento de las células vegetales y, por lo tanto, el tamaño y la forma futuros de la planta. El método basado en AFM presentado aquí complementa las técnicas existentes que se utilizan para estudiar las propiedades de las paredes celulares de las plantas. Permite investigar la elasticidad de las paredes celulares, que pertenecen a los tejidos internos de la planta. Utilizando el método presentado, se mapearon las…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer al Dr. Dmitry Suslov (Universidad Estatal de San Petersburgo, San Petersburgo, Rusia) y a la Prof. Mira Ponomareva (Instituto de Investigación Científica Tártara de Agricultura, FRC KazSC RAS, Kazán, Rusia) por proporcionar semillas de maíz y centeno, respectivamente. El método presentado fue desarrollado en el marco del Proyecto de la Fundación Rusa de Ciencias No. 18-14-00168 otorgado a LK. La parte del trabajo (obtención de los resultados presentados) fue realizada por AP con el apoyo financiero de la asignación gubernamental para el Centro Científico FRC Kazan de RAS.
Materials
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | – | – | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | – | – | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | – | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | – | – | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | – | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | – | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | – |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | – |
| Ultrapure water | – | – | – |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
Riferimenti
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