כלים מיקרופלואידיים לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות ברמה התאית
Summary
בשל האטימות של האדמה, לא ניתן לדמיין בקלות אינטראקציות בין המיקרובים המרכיבים אותה עם רזולוציה תאית. כאן מוצגים שני כלים מיקרופלואידיים, המציעים הזדמנויות חדשות לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות. המכשירים הם רב-תכליתיים ופשוטים לשימוש, ומאפשרים שליטה מרחבית-טמפורלית גבוהה והדמיה ברזולוציה גבוהה ברמה התאית.
Abstract
פטריות נימה הן תושבות מוצלחות של הקרקע וממלאות תפקיד מרכזי במערכות אקולוגיות בקרקע, כגון בפירוק חומר אורגני ואנאורגני, כמו גם בוויסות רמות חומרי ההזנה. שם הם גם מוצאים הזדמנויות רבות לקיים אינטראקציה עם מגוון של מיקרובים אחרים כגון חיידקים או פטריות אחרות. עם זאת, חקר אינטראקציות פטרייתיות ברמה התאית יכול להיות מאתגר בשל האופי דמוי הקופסה השחורה של האדמה. כלים מיקרופלואידיים חדשים מפותחים לחקר אינטראקציות פטרייתיות; מודגשות שתי פלטפורמות שנועדו לחקור אינטראקציות חיידקיות-פטרייתיות ופטרייתיות-פטרייתיות. בתוך מיקרו-ערוצים אלה, ניתן לנטר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות בסביבות פיסיקליות-כימיות מבוקרות ברזולוציה טמפורלית ומרחבית גבוהה יותר ממה שהיה אפשרי בעבר. היישום של כלים אלה הניב תובנות ביולוגיות חדשניות רבות, כגון תצפית על התקשרות קוטבית חיידקית להיפאים או חשיפת אנטגוניזמים פטרייתיים-פטרייתיים לא אופייניים. מאפיין מרכזי של מתודולוגיות אלה מתייחס לקלות השימוש בכלי זה על ידי אנשים שאינם מומחים, מה שמניב טכנולוגיות הניתנות לתרגום גבוה לשימוש במעבדות מיקרוביולוגיה.
Introduction
אדמה היא סביבה מגוונת במיוחד המכילה שפע של מיקרואורגניזמים המסייעים למחזורי פחמן וזרחן 1,2. פטריות נימה הן מרכיב מרכזי במערכות אקולוגיות רבות כמפרקים של חומר אורגני ואנאורגני ויכולות לשפר את התזונה של צמחים באמצעות יצירת יחסים סימביוטיים 3,4. בתוך האדמה, פטריות מתקשרות באופן דינמי עם מספר רב של מיקרובים כגון פטריות אחרות5, חיידקים6, וירוסים7 ונמטודות8. לאינטראקציות אלה יש השלכות משמעותיות על בריאות הקרקע והצמחים. עם זאת, בשל היעדר מערכות ניסיוניות מתאימות המסוגלות להדמיית מיקרואורגניזמים מתקשרים עם מיקרואורגניזמים ברזולוציה גבוהה, רבים נותרו בלתי מוגדרים.
לחקירות הנוגעות לאינטראקציות בין חיידקים לפטריות (BFIs) ולאינטראקציות פטרייתיות-פטרייתיות (FFIs) יש יישומים בעלי ערך במגוון תחומים, כולל חומרים אנטי-מיקרוביאליים ברפואה וחומרי הדברה ביולוגית בחקלאות. לדוגמה, הפטרייה Coprinopsis cinerea מייצרת את הפפטיד קופסין, אשר הוכח כי הוא מפגין פעילות אנטיבקטריאלית נגד הפתוגן האנושי ליסטריה מונוציטוגנים9. באופן דומה, התרכובת שמקורה בפטריות, griseofulvin, נמצאת בשימוש נרחב כטיפול בזיהומים פטרייתיים אנושיים והיא גם מסוגלת לעכב את הצמיחה של הפטרייה הפתוגנית הצמחית Alternaria solani10,11. מספר זנים של החיידק השוכן בקרקע, Bacillus subtilis, הוכחו גם כחומרים ביו-מבוקרים יעילים של הפתוגן הצמחי הפטרייתי Rhizoctonia solani 12,13. עם זאת, בשל מגבלות הקשורות למתודולוגיות מסורתיות, BFIs ו- FFIs אינם מובנים היטב ברמה של תאים בודדים.
מחקרים קונבנציונליים חוקרים בדרך כלל BFIs ו-FFIs על המאקרו-קנה מידה באמצעות לוחות אגר עם שני מינים או יותר שנמצאים בעימות. האינטראקציה ביניהם נבחנת על ידי מדידת קצבי גדילה וייצור מטבוליטים של המינים המתעמתים 14,15,16; עם זאת, מתודולוגיה זו נפתרת רק לרמת המושבה. כדי לחקור אינטראקציות ברמה התאית, ניתן לטפח אינוקולנטים חיידקיים ופטרייתיים על גבי שקופיות מיקרוסקופ זכוכית מצופות באגר שמצולמות לאחר מכן תחת מיקרוסקופ17. עם זאת, זה יכול להיות קשה לעקוב אחר hypha יחיד באמצעות שקופיות מיקרוסקופ בשל חוסר כליאה, כלומר תמונות קיטועי זמן קשה יותר להשיג. יתר על כן, ההזדמנות להגביל מרחבית מיקרואורגניזמים אחרים בתוך אזורים מוגדרים של התפטיר הפטרייתי או ליצור סביבות כימיות מוגדרות שניתן להפריע להן, למשל, אינה אפשרית במערכים כאלה. אופי “הקופסה השחורה” של האדמה מוסיף גם למורכבות של חקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות ברמה של תאים בודדים18. על ידי התבוננות במינים מתקשרים הרחק מהמגוון המדהים של המיקרוביום הקרקעי, ניתן להעריך את האופן המדויק שבו חברים בודדים מתקשרים. לפיכך, קיים צורך מתמשך בפלטפורמות רב-תכליתיות המאפשרות הדמיה חד-תאית ברזולוציה גבוהה של BFIs ו-FFIs.
טכנולוגיות מיקרופלואידיות, מה שמכונה מערכות מעבדה על שבב, מספקות פלטפורמה אידיאלית לחקר BFIs ו- FFIs ברמה של תאים בודדים. תחום המיקרופלואידיקה, שמקורו בטכנולוגיות שפותחו לצורך אנליזה כימית ומיקרו-אלקטרוניקה, אומץ על ידי מדעי הביולוגיה19. טכנולוגיות מיקרופלואידיות מווסתות כמויות קטנות של נוזלים בתוך רשת מותאמת אישית של תעלות ממוזערות, בעלות ממד אחד לפחות בסולם המיקרומטר, והשימוש בהן במחקר ביולוגי מתרחבל-20. בפרט, התקנים מיקרופלואידיים פותחו כדי לבחון את הצמיחה של פטריות נימה 21,22,23,23,24,25,26,27,28,29,30. אחד היתרונות של שימוש בטכנולוגיה זו הוא שכליאה של hyphae והתפלגות חומרי המזון בתוך מיקרו-ערוצים דומה יותר למבנה סביבת הקרקע מאשר שיטות אגר קונבנציונליות31. לאחרונה, פלטפורמות מיקרופלואידיות שימשו כדי לחקור אינטראקציות בין נויטרופילים אנושיים לבין פתוגנים פטרייתיים32, חיידקים ושורשי צמחים33, כמו גם פטריות ונמטודות34,35.
אחד היתרונות הרבים של שימוש במיקרופלואידיקה לחקר אינטראקציות מיקרוביאליות כולל את הבקרה הספציפית של סביבת המיקרו-ערוצים. לדוגמה, ניתן לנצל משטרי זרימה למינריים כדי ליצור גרדיאנטים מוגדרים של ריכוז, וזה שימושי במיוחד כאשר בוחנים את הכימוטקסיס החיידקי36. יתרון נוסף הוא שהאופי השקוף של פולי(דימתילסילוקסן) (PDMS), פולימר אלסטומרי זול וניתן להתאמה ביולוגית הנפוץ בייצור התקנים מיקרופלואידיים, מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים בודדים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של שדה בהיר ופלואורסצנטי37. באופן דומה, כליאה של מיקרובים בתוך מיקרו-ערוצים פירושה שניתן לבצע ניסויים בהילוך מהיר העוקב אחר תאים בודדים, מה שמאפשר לרשום ולכמת תגובות תאיות בודדות37. לבסוף, מכיוון שניתן לתכנן התקנים מיקרופלואידיים כך שיהיו ידידותיים למשתמש, הם יכולים להיות מועסקים בקלות על ידי אנשים שאינם מומחים38.
קידום הידע על יחסי הגומלין בין מיקרואורגניזמים שוכני קרקע חשוב לשיפור שיטות ניהול אקולוגיות בנות קיימא השומרות על המגוון הביולוגי ולמיתון ההשפעה של שינויי האקלים על סביבות יבשתיות39. לפיכך, פיתוח כלים מיקרופלואידיים חדשניים הוא בסיסי להרחבת ההבנה של פטריות והאינטראקציות שלהן ברמה התאית. הפרוטוקול כאן יתמקד בשני התקנים מיקרופלואידיים שיוצרו עבור המחקר של BFIs40 ו-FFIs41 כפי שהם מיוצגים באיור 1.
איור 1: ייצוג חזותי וסכמטי של התקני האינטראקציה החיידקית-פטרייתית (BFI) והתקני האינטראקציה הפטרייתית-פטרייתית (FFI). תקע תפטיר ממוקם בכניסה לקצה אחד של המיקרו-ערוצים כדי לאפשר צמיחת היפל לתוך המכשיר. המפרצון החיידקי נמצא בקצה הנגדי. סרגל קנה מידה = 5 מ”מ. (B) סקירה סכמטית של התקן ה- BFI, המתארת את המיקום של מפרצוני החיידקים ואת כיוון הצמיחה ההיפלית באמצעות מיקרו-ערוצי האינטראקציה. הערוצים הם בעומק של 10 מיקרומטר, ברוחב של 100 מיקרומטר ובאורך של 7 מ”מ, עם 28 ערוצי תצפית בסך הכל. (C) מבחן עימות על לוח אגר בין Coprinopsis cinerea ו Bacillus subtilis NCIB 3610, סרגל קנה מידה = 20 מ”מ (משמאל). תמונות מיקרוסקופיה מראות את האינטראקציה בין C. cinerea ו– B. subtilis NCIB 3610 בתוך המיקרו-ערוץ (האמצעי והימין), כלומר חיבור קוטבי של חיידקים להיפאה פטרייתית. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר (באמצע) ו- 10 מיקרומטר (מימין). (D) תמונה של מכשיר ה-FFI המחובר לצלחת פטרי בעלת תחתית זכוכית, מחוסנת פעמיים בתקעים תפטיריים. סרגל קנה מידה = 1 ס”מ. (E) סקירה סכמטית של התקן ה- FFI. שני תקעי אינוקולנט פטרייתיים מוכנסים לתוך המפרצים בשני קצות המכשיר, ומאפשרים חקירה היפלית של המיקרו-ערוצים. ערוצי הבקרה מחוברים לכניסה פטרייתית אחת בלבד ויש להם ערוץ ללא מוצא, מה שמונע אינטראקציות בין פטריות הבדיקה. ערוצי אינטראקציה מחברים בין שני המפרצים הפטרייתיים ומאפשרים אינטראקציות היפאליות בין הנבדקים בתוך המיקרו-ערוץ. כל תעלת אינטראקציה מורכבת מ-18 מקטעים בצורת יהלום, באורך כולל של 8.8 מ”מ (490 x 430 מיקרומטר ליהלום), בעומק של 10 מיקרומטר ובבעל אזור חיבור בין כל יהלום של 20 מיקרומטר. סוגי הערוצים משוכפלים, סרגלי קנה מידה = 1 מ”מ. (F) אזור אינטראקציה בין שתי חזיתות היפל מתקרבות, הגדלות מקצוות מנוגדים של ערוץ האינטראקציה המחובר. תמונת מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה, סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר. הלוחות באיור זה שונו מ-Stanley et al., 2014 (A-C)40 ו-Gimeno et al., 2021 (D-F)41. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מציג פרוטוקול לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות באמצעות מיקרופלואידיקה של ערוצים. המחברים שואפים להדגים את הרבגוניות של מכשירים אלה ולעודד הסתגלות שתתאים לתחומי העניין של החוקר. באמצעות מכשירי BFI ו-FFI למופת, ניתן לחקור אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות בפירוט רב יותר מאש…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים בתמיכה כספית מהמחלקה לביו-הנדסה באימפריאל קולג’ בלונדון ומקרן Leverhulme (הפניה למענק מחקר: RPG-2020-352).
Materials
| Agar | Difco Laboratories | 214010 | Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes |
| Aluminum foil | Fisher Scientific Ltd | 11759408 | |
| AutoCAD 2021 | Autodesk, USA | ||
| Autoclave (VX-75) | Systec | ||
| Centrifuge (5810R) | Eppendorf | ||
| Chlorotrimethysilane | Merck Life Sciences | 386529 | CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area. |
| Cork borer | SLS | COR1000 | |
| Developer solution (mr-Dev 600) | Microresist Technologies | CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable | |
| Erlenmeyer flasks | VWR | 214-1108 | e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs |
| Ethanol (70% v/v) | Fisher Scientific Ltd | E/0650DF/15 | Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade) |
| Fiji | ImageJ | Exemplar software package for imaging processing | |
| Filtered, compressed air | Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used. | ||
| Flat-headed wafer tweezers | SLS | INS5026 | |
| Forceps | Fisher Scientific Ltd | 10008051 | Bent, sharp |
| Glass bottom petri dish | World Precision Instruments | FD35-100 | 35 mm |
| Glass bottom petri dish | World Precision Instruments | FD5040-100 | 50 mm |
| Glass crystallisation dishes | VWR | 216-1865 | Used for washing of PDMS slabs |
| Glass crystallisation dishes | VWR | 216-1866 | Used in the development of master moulds |
| Glass media bottles | Fisher Scientific Ltd | 15456113 | e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs |
| Glass syringe (Hamilton) | Fisher Scientific Ltd | 10625251 | Used for dispensing chlorotrimethylsilane |
| Hot plate (HP 160 III BM) | SAWATEC | ||
| Inoculation loop | VWR | COPA175CS01 | |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| Laminar flow hood | Air Science (PCR) | Exemplar laminar flow hood used for device fabrication | |
| LB medium | Fisher Scientific Ltd | BP9723-500 | Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture |
| Light emitting diode light engine (LedHUB) | Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH | Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence) | |
| MA6 Ultraviolet mask aligner | Suss Microtec | ||
| Malt extract | VWR | 84618 | Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar) |
| Mask Writer | Applied Materials | 4700DP | Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography |
| Master mould plastic mount | 3D-printed bespoke holder manufactured in-house | ||
| Microbiological safety cabinet (BioMat2) | Contained Air Solutions | Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation | |
| Milli-Q purified water | Available as standard in biology labs. | ||
| NaOH | Fisher Scientific Ltd | BP359-500 | |
| NIS-Elements Advanced Research imaging software | Nikon | Exemplar software package for image acquisition | |
| NIS-Elements Free Viewer | Nikon | Exemplar software package for viewing acquired images | |
| Oven (Binder BD115) | Fisher Scientific Ltd | 15602126 | Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS) |
| Oven (CLO-2AH-S) | KOYO | Used for preparing silicon wafers | |
| Parafilm | Bemis | HS234526B | transparent film |
| Petri dishes, square sterile | Fisher Scientific Ltd | 11708573 | 120.5 mm |
| Petri dishes, sterile | Fisher Scientific Ltd | 15370366 | 90 mm |
| Photolithography mask | Micro Lithography Services Ltd. UK | ||
| Plasma cleaner (Zepto) | Diener Electronic | 100012601 | |
| Plastic cup | Semadeni | 8323 | |
| Plastic spatula | Semadeni | 3340 | |
| Portable precision balance (OHAUS Scout) | Fisher Scientific Ltd | 15519631 | Used for weighing PDMS, media components etc. |
| Precision cutter | Syneo | HS1251135P1183 | Cutting edge diameter: 3.18 mm |
| Precision cutter | Syneo | HS1871730P1183S | Cutting edge diameter: 4.75 mm |
| Profilometer | Bruker | Dektak XT-stylus | |
| Razor blades | Häberle Labortechnik | 9156110 | |
| Refridgerator | Haden | 4-6 °C | |
| Retiga R1 CCD camera | Qimaging | Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions | |
| Scotch magic tape | Office Depot | 3969954 | 19 mm invisible tape; clear tape |
| Shaking incubator (Cole-Parmer SI500) | Fisher Scientific Ltd | 10257954 | |
| Silicon wafer | Inseto | 100 mm | |
| Soda lime glass plate | Inseto | 125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Spincoater | SAWATEC | SM-180-BM | |
| SU-8 2010 photoresist | MicroChem | CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment. | |
| Sylgard 184 elastomer kit | VWR | 634165S | Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices |
| Temperature controlled incubator | Okolab | Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions | |
| Ti2-E inverted epifluorescence microscope | Nikon | MEA54000 | Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions |
| Ultrasonic cleaner S-Line | Fisher Scientific Ltd | FB15050 | |
| Vacuum desiccator | Fisher Scientific Ltd | 10528861 | Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators |
| x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens | Nikon | MRH20105 | Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions |
| x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens | Nikon | MRH48230 | Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions |
Riferimenti
- Zhu, Y. -. G., Miller, R. M. Carbon cycling by arbuscular mycorrhizal fungi in soil-plant systems. Trends in Plant Science. 8 (9), 407-409 (2003).
- Dai, Z., et al. Long-term nutrient inputs shift soil microbial functional profiles of phosphorus cycling in diverse agroecosystems. The ISME Journal. 14 (3), 757-770 (2020).
- Op De Beeck, M., et al. Regulation of fungal decomposition at single-cell level. The ISME Journal. 14 (4), 896-905 (2020).
- Bender, S. F., et al. Symbiotic relationships between soil fungi and plants reduce N2O emissions from soil. The ISME Journal. 8 (6), 1336-1345 (2014).
- Dullah, S., et al. Melanin production and laccase mediated oxidative stress alleviation during fungal-fungal interaction among basidiomycete fungi. IMA Fungus. 12 (1), 33 (2021).
- Deveau, A., et al. Bacterial-fungal interactions: ecology, mechanisms and challenges. FEMS Microbiology Reviews. 42 (3), 335-352 (2018).
- Bian, R., et al. Facilitative and synergistic interactions between fungal and plant viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (7), 3779-3788 (2020).
- Jiang, X., Xiang, M., Liu, X. Nematode-trapping fungi. Microbiology Spectrum. 5 (1), (2017).
- Essig, A., et al. a novel peptide-based fungal antibiotic interfering with the peptidoglycan synthesis. Journal of Biological Chemistry. 289 (50), 34953-34964 (2014).
- Tang, H. -. Y., Zhang, Q., Li, H., Gao, J. -. M. Antimicrobial and allelopathic metabolites produced by Penicillium brasilianum. Natural Product Research. 29 (4), 345-348 (2015).
- Bai, Y. -. B., et al. Antifungal activity of griseofulvin derivatives against phytopathogenic fungi In vitro and In vivo and three-dimensional quantitative structure-activity relationship analysis. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (22), 6125-6132 (2019).
- Solanki, M. K., et al. Characterization of antagonistic-potential of two Bacillus strains and their biocontrol activity against Rhizoctonia solani in tomato. Journal of Basic Microbiology. 55 (1), 82-90 (2015).
- Jamali, H., Sharma, A., Srivastava, A. K. Biocontrol potential of Bacillus subtilis RH5 against sheath blight of rice caused by Rhizoctonia solani. Journal of Basic Microbiology. 60 (3), 268-280 (2020).
- Válková, H., Novotný, &. #. 2. 6. 8. ;., Malachová, K., Šlosarčíková, P., Fojtík, J. Effect of bacteria on the degradation ability of Pleurotus ostreatus. Science of The Total Environment. 584-585, 1114-1120 (2017).
- Leyva-Rojas, J. A., Coy-Barrera, E., Hampp, R. Interaction with soil bacteria affects the growth and amino acid content of Piriformospora indica. Molecules. 25 (3), 572 (2020).
- Dullah, S., et al. Fungal interactions induce changes in hyphal morphology and enzyme production. Mycology. 12 (4), 279-295 (2021).
- Marfetán, J. A., Romero, A. I., Folgarait, P. J. Pathogenic interaction between Escovopsis weberi and Leucoagaricus sp.: mechanisms involved and virulence levels. Fungal Ecology. 17, 52-61 (2015).
- Cortois, R., De Deyn, G. B. The curse of the black box. Plant and Soil. 350 (1), 27-33 (2012).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
- Hanson, K. L., et al. Fungi use efficient algorithms for the exploration of microfluidic networks. Small. 2 (10), 1212-1220 (2006).
- Held, M., Edwards, C., Nicolau, D. V. Probing the growth dynamics of Neurospora crassa with microfluidic structures. Fungal Biology. 115 (6), 493-505 (2011).
- Thomson, D. D., et al. Contact-induced apical asymmetry drives the thigmotropic responses of Candida albicans hyphae. Cellular Microbiology. 17 (3), 342-354 (2015).
- Lee, K. K., Labiscsak, L., Ahn, C. H., Hong, C. I. Spiral-based microfluidic device for long-term time course imaging of Neurospora crassa with single nucleus resolution. Fungal Genetics and Biology. 94, 11-14 (2016).
- Asenova, E., Lin, H. Y., Fu, E., Nicolau, D. V., Nicolau, D. V. Optimal fungal space searching algorithms. IEEE Transactions on NanoBioscience. 15 (7), 613-618 (2016).
- Soufan, R., et al. Pore-scale monitoring of the effect of microarchitecture on fungal growth in a two-dimensional soil-like micromodel. Frontiers in Environmental Science. 6, (2018).
- Uehling, J. K., et al. Microfluidics and metabolomics reveal symbiotic bacterial-fungal interactions between Mortierella elongata and Burkholderia include metabolite exchange. Frontiers in Microbiology. 10, 2163 (2019).
- Millet, L. J., et al. Increasing access to microfluidics for studying fungi and other branched biological structures. Fungal Biology and Biotechnology. 6 (8), 1-14 (2019).
- Baranger, C., Fayeulle, A., Le Goff, A. Microfluidic monitoring of the growth of individual hyphae in confined environments. Royal Society Open Science. 7 (8), 191535 (2020).
- Aleklett, K., Ohlsson, P., Bengtsson, M., Hammer, E. C. Fungal foraging behaviour and hyphal space exploration in micro-structured Soil Chips. The ISME Journal. 15 (6), 1782-1793 (2021).
- Aleklett, K., et al. Build your own soil: exploring microfluidics to create microbial habitat structures. The ISME Journal. 12 (2), 312-319 (2018).
- Ellett, F., Jorgensen, J., Frydman, G. H., Jones, C. N., Irimia, D. Neutrophil interactions stimulate evasive hyphal branching by Aspergillus fumigatus. PLOS Pathogens. 13 (1), 1006154 (2017).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Schmieder, S. S., et al. Bidirectional propagation of signals and nutrients in fungal networks via specialized hyphae. Current Biology. 29 (2), 217-228 (2019).
- Tayyrov, A., Stanley, C. E., Azevedo, S., Künzler, M. Combining microfluidics and RNA-sequencing to assess the inducible defensome of a mushroom against nematodes. BMC Genomics. 20 (1), 243 (2019).
- Stanley, C. E., Grossmann, G., Casadevall i Solvas, X., deMello, A. J. Soil-on-a-Chip: microfluidic platforms for environmental organismal studies. Lab on a Chip. 16 (2), 228-241 (2016).
- Stanley, C. E., vander Heijden, M. G. A. Microbiome-on-a-Chip: new frontiers in plant-microbiota research. Trends in Microbiology. 25 (8), 610-613 (2017).
- Ortseifen, V., Viefhues, M., Wobbe, L., Grünberger, A. Microfluidics for biotechnology: bridging gaps to foster microfluidic applications. Frontiers in Bioengineering & Biotechnology. 8, 589074 (2020).
- Jansson, J. K., Hofmockel, K. S. The soil microbiome-from metagenomics to metaphenomics. Current Opinion in Microbiology. 43, 162-168 (2018).
- Stanley, C. E., et al. Probing bacterial-fungal interactions at the single cell level. Integrative Biology (Camb). 6 (10), 935-945 (2014).
- Gimeno, A., et al. A versatile microfluidic platform measures hyphal interactions between Fusarium graminearum and Clonostachys rosea in real-time. Communications Biology. 4 (1), 262 (2021).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Stanley, C. E., et al. Fabrication and use of the dual-flow-RootChip for the imaging of Arabidopsis roots in asymmetric microenvironments. Bio-protocol. 8 (18), 3010 (2018).
- Choi, C. -. H., Lee, H., Weitz, D. A. Rapid patterning of PDMS microfluidic device wettability using syringe-vacuum-induced segmented flow in nonplanar geometry. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (4), 3170-3174 (2018).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. (63), e3064 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Harting, R., et al. Pseudomonas strains induce transcriptional and morphological changes and reduce root colonization of Verticillium spp. Frontiers in Microbiology. 12, 652468 (2021).
- Boenisch, M. J. . Structural and molecular characterisation of the penetration process of Fusarium graminearum during Fusarium head blight infection. , (2013).
- Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlovsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum and V. dahliae with Brassica napus detected with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
- Ghanem, N., Stanley, C. E., Harms, H., Chatzinotas, A., Wick, L. Y. Mycelial effects on phage retention during transport in a microfluidic platform. Environmental Science & Technology. 53 (20), 11755-11763 (2019).
- Alrifaiy, A., Lindahl, O. A., Ramser, K. Polymer-based microfluidic devices for pharmacy, biology and tissue engineering. Polymers. 4 (3), 1349-1398 (2012).
- Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E. Microfluidics: reframing biological enquiry. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (9), 554-567 (2015).
- Hoelzle, D., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
