Hepatosellüler Karsinomun Ortotopik Fare Modelinde Non-İnvaziv PET/MR Görüntüleme
Summary
Burada, hepatik arter ligasyonu olan ve olmayan ortopik hepatosellüler karsinom ksenogreftleri oluşturmak ve [18 F]Floromisonidazol ([18 F]FMISO) ve [18 F]Florodeoksiglukoz ([18F]FDG) kullanılarak tümör hipoksisinin non-invaziv pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntülemesini gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
İnsan hastalığını özetleyen hepatosellüler karsinomun (HCC) klinik öncesi deneysel modelleri, tümörigenezi incelemek ve yeni terapötik yaklaşımları değerlendirmek için önemli bir araçtır. Pozitron emisyon tomografisi (PET) kullanılarak yapılan non-invaziv tüm vücut görüntüleme, dokuların moleküler düzeyde in vivo özellikleri hakkında gerçek zamanlı olarak kritik bilgiler sağlar. Burada, tümör hipoksisini indüklemek için hepatik arter ligasyonu (HAL) olan ve olmayan ortopik HCC ksenogreft oluşturulması ve [18 F]Floromisonidazol ([18 F]FMISO) ve [18 F]Florodeoksiglukoz ([18F]fdg) evcil hayvan/manyetik rezonans (MR) görüntüleme kullanılarak tümör metabolizmasının in vivo olarak değerlendirilmesi için bir protokol sunuyoruz. Tümör hipoksisi, hipoksi belirteci [18 F] FMISO kullanılarak kolayca görselleştirilebilir ve [18 F] FMISO alımının, HAL uygulanan HCC farelerinde, HAL olmayan gruba göre daha yüksek olduğu, oysa [18F] FDG’nin iki grup arasında tümör hipoksisini ayırt edemediği bulunmuştur. HAL tümörleri ayrıca hipoksiye yanıt olarak daha yüksek düzeyde hipoksi ile indüklenebilir faktör (HIF)-1α ekspresyonu gösterdi. HAL tümörlerinin nicelleştirilmesi, standartlaştırılmış değer alımı (SUV) yaklaşımına dayanarak [18F] FMISO alımında 2.3 kat artış göstermiştir.
Introduction
Hepatosellüler karsinom (HCC), 2020 yılında 900.000’den fazla yeni vaka ve 800.000 ölümle dünya çapında en çok teşhis edilen altıncı kanser ve kanserden üçüncü en yaygın ölüm nedenidir1. En büyük risk faktörü, viral enfeksiyonlar (hepatit B ve C virüsleri), alkol kötüye kullanımı, diyabet ve alkolsüz steatohepatit2’nin bir sonucu olarak ortaya çıkan sirozdur. HCC’nin yönetimi oldukça karmaşıktır ve hastalığın evrelemesine bağlı olarak cerrahi rezeksiyon, termal veya kimyasal ablasyon, transplantasyon, transarteriyel kemoembolizasyon, radyasyon ve kemoterapi dahil olmak üzere çeşitli tedavi seçenekleri mevcuttur 2,3. HCC, küratif amaçlı tedavi uygulanan hastaların %70’inde hastalık nükseden kemoterapiye dirençli bir tümördür2.
Yüksek derecede tümör heterojenliğine rağmen, HCC iki yaygın sonuçla ilişkilidir: (i) HCC çok hipoksiktir ve (ii) tümör hipoksisi daha büyük tümör agresifliği ve tedavi başarısızlığı ile bağlantılıdır. HCC hücrelerinin kontrolsüz çoğalması, vaskülarizasyondan önce yüksek bir oksijen tüketim oranı ile sonuçlanır ve böylece hipoksik bir mikro ortam yaratır. Düşük tümöral içi oksijen seviyeleri daha sonra tümör agresifliğini ve tedavi yanıtını etkileyen bir dizi biyolojik yanıtı tetikler. Hipoksi ile indüklenebilir faktörler (HIF’ler) genellikle hipoksi 2,3’e yanıtta temel transkripsiyonel düzenleyiciler olarak kabul edilir. Bu nedenle, hipoksiyi tespit etme yeteneği, neoplastik dokuları görselleştirmek ve invaziv prosedürler gerektiren erişilemeyen bölgeleri tanımlamak için çok önemlidir. Ayrıca, tümör agresifliğine yol açan moleküler değişikliklerin daha iyi anlaşılmasına ve hasta tedavi sonuçlarının iyileştirilmesine yardımcı olur.
Pozitron emisyon tomografisi (PET) kullanılarak moleküler görüntüleme, HCC de dahil olmak üzere birçok kanserin tanı ve evrelemesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Özellikle, [18 F] Florodeoksiglukoz ([18F] FDG) ve [11 C]Asetat içeren çift izleyicili PET görüntülemenin kombine kullanımı, HCC tanısında genel duyarlılığı önemli ölçüde artırabilir 4,5. Öte yandan, hipoksinin görüntülenmesi, yaygın olarak kullanılan hipoksik belirteç [18 F] Floromisonidazol ([18F] FMISO) kullanılarak elde edilebilir. Klinik pratikte, hipoksinin non-invaziv değerlendirmesi, radyasyon tedavisi planlaması için çeşitli tümör tipleri ve bölgeler arasında ayrım yapmak için önemlidir6.
Preklinik görüntüleme, farklı hastalıklar için fare modellerinin non-invaziv ve uzunlamasına değerlendirilmesinde vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir. Sağlam ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir HCC modeli, insan HCC’sinin patofizyolojisine ve yeni tedavilerin değerlendirilmesine yönelik klinik öncesi ve translasyonel araştırmalar için önemli bir platformu temsil etmektedir. PET görüntüleme ile birlikte, herhangi bir zaman noktası için moleküler düzeyde önemli bilgiler sağlamak için in vivo davranışlar açıklığa kavuşturulabilir. Burada, hepatik arter ligasyonu (HAL) ortotopik HCC ksenogreftlerinin üretimi ve [18 F] FMISO ve [18F] FDG PET / MR kullanılarak in vivo tümör metabolizmalarının analizi için bir protokol tarif ediyoruz. HAL’in dahil edilmesi, tümör hipoksisini in vivo olarak incelemek için transgenik veya kimyasal olarak indüklenen HCC fareleri ksenogreftlerinin uygun bir modelini oluşturur, çünkü HAL, tümör içi hipoksi 7,8’i indüklemek için arteriyel kan akışını etkili bir şekilde bloke edebilir. Ek olarak, pimonidazol kullanılarak yapılan ex vivo immünohistokimyasal boyamanın aksine, hipoksi sonucu tümör metabolizmasındaki değişiklikler, PET görüntüleme kullanılarak kolayca görselleştirilebilir ve invaziv olmayan bir şekilde ölçülebilir, böylece tedavi yanıtının uzunlamasına değerlendirilmesi veya direncin ortaya çıkışının ölçülmesi 3,7,8 . Burada gösterilen yöntemimiz, HCC biyolojisini in vivo olarak incelemek için PET / MR görüntüleme kullanarak tümör hipoksisinin non-invaziv izlenmesi ile birlikte sağlam bir hipoksik HCC modelinin oluşturulmasına izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, subkutan tümörler kullanılarak karaciğer ortotopik HCC ksenogreftlerinde HAL uygulama prosedürleri ve [18 F] FMISO ve [18F] FDG PET / MR kullanılarak ortotopik ksenogreftlerde tümör hipoksisinin non-invaziv izlenmesi için yöntemler tanımlanmıştır. İlgi alanımız, erken tanı ve tedaviye yanıt değerlendirmesi için çeşitli kanser ve hastalık modellerinin metabolik görüntülemesinde yatmaktadır 11,13,14,15</s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Küçük hayvan görüntüleme deneyleri için Hong Kong Antikanser Güven Fonu, Hong Kong Araştırma Hibeleri Konseyi İşbirlikçi Araştırma Fonu’nun (CRF C7018-14E) desteğini kabul ediyoruz. Ayrıca, Hong Kong Üniversitesi’ndeki Moleküler Görüntüleme ve Tıbbi Siklotron Merkezi’nin (MIMCC) [18F] FMISO ve [18F] FDG’nin sağlanması için verdiği desteğe teşekkür ederiz.
Materials
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
Riferimenti
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Chen, C., Lou, T. Hypoxia inducible factors in hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 8 (28), 46691-46703 (2017).
- Lu, R. -. C., et al. Positron-emission tomography for hepatocellular carcinoma: Current status and future prospects. World Journal of Gastroenterology. 25 (32), 4682-4695 (2019).
- Larsson, P., et al. Adding 11C-acetate to 18F-FDG at PET examination has an incremental value in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Molecular Imaging and Radionuclide Therapy. 21 (1), 6-12 (2012).
- Huo, L., et al. Kinetic analysis of dynamic 11C-acetate PET/CT imaging as a potential method for differentiation of hepatocellular carcinoma and benign liver lesions. Theranostics. 5 (4), 371-377 (2015).
- Lopci, E., et al. PET radiopharmaceuticals for imaging of tumor hypoxia: A review of the evidence. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 4 (4), 365-384 (2014).
- Mao, X., et al. Mechanisms through which hypoxia-induced caveolin-1 drives tumorigenesis and metastasis in hepatocellular carcinoma. Ricerca sul cancro. 76 (24), 7242-7253 (2016).
- Kung-Chun Chiu, D., et al. Hypoxia regulates the mitochondrial activity of hepatocellular carcinoma cells through HIF/HEY1/PINK1 pathway. Cell Death & Disease. 10 (12), 934 (2019).
- Li, Y., et al. Establishment of cell clones with different metastatic potential from the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97. World Journal of Gastroenterology. 7 (5), 630-636 (2001).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42 (6), 217-224 (2013).
- Liu, Q., Tan, K. V., Chang, H. C., Khong, P. L., Hui, X. Visualization and quantification of brown and beige adipose tissues in mice using [18F] FDG micro-PET/MR imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (173), e62460 (2021).
- Lin, W. -. H., et al. Hypoxia-activated cytotoxic agent tirapazamine enhances hepatic artery ligation-induced killing of liver tumor in HBx transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11937-11942 (2016).
- Wong, T. L., et al. CRAF methylation by PRMT6 regulates aerobic glycolysis-driven hepatocarcinogenesis via ERK-dependent PKM2 nuclear relocalization and activation. Hepatology. 71 (4), 1279-1296 (2020).
- Yang, X., et al. Development of cisplatin-loaded hydrogels for trans-portal vein chemoembolization in an orthotopic liver cancer mouse model. Drug Delivery. 28 (1), 520-529 (2021).
- Shi, J., et al. Longitudinal evaluation of five nasopharyngeal carcinoma animal models on the microPET/MR platform. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (5), 1497-1507 (2021).
- Kilian, K., et al. Imaging of hypoxia in small animals with F fluoromisonidasole. Nukleonika. 61 (2), 219-223 (2016).
- Kawamura, M., et al. Evaluation of optimal post-injection timing of hypoxic imaging with 18F-Fluoromisonidazole-PET/CT. Molecular Imaging and Biology. 23 (4), 597-603 (2021).
