Imágenes PET/MR no invasivas en un modelo ortotópico de ratón de carcinoma hepatocelular
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para crear xenoinjertos de carcinoma hepatocelular ortotópico con y sin ligadura de la arteria hepática y realizar imágenes no invasivas de tomografía por emisión de positrones (PET) de hipoxia tumoral utilizando [18 F] fluoromisonidazol ([18 F] FMISO) y [18 F] fluorodesoxiglucosa ([18F] FDG).
Abstract
Los modelos experimentales preclínicos de carcinoma hepatocelular (CHC) que recapitulan la enfermedad humana representan una herramienta importante para estudiar la tumorigénesis y evaluar nuevos enfoques terapéuticos. Las imágenes no invasivas de cuerpo entero mediante tomografía por emisión de positrones (PET) proporcionan información crítica sobre las características in vivo de los tejidos a nivel molecular en tiempo real. Presentamos aquí un protocolo para la creación de xenoinjertos ortotópicos de CHC con y sin ligadura de la arteria hepática (HAL) para inducir hipoxia tumoral y la evaluación de su metabolismo tumoral in vivo utilizando [18 F]Fluoromisonidazol ([18 F]FMISO) y [18 F]Fluorodesoxiglucosa ([18F]FDG) PET/resonancia magnética (MR). La hipoxia tumoral se pudo visualizar fácilmente utilizando el marcador de hipoxia [18 F] FMISO, y se encontró que la captación de [18 F] FMISO fue mayor en ratones HCC que se sometieron a HAL que en el grupo sin HAL, mientras que [18F] FDG no pudo distinguir la hipoxia tumoral entre los dos grupos. Los tumores HAL también mostraron un nivel más alto de expresión del factor inducible por hipoxia (HIF)-1α en respuesta a la hipoxia. La cuantificación de los tumores HAL mostró un aumento de 2,3 veces en la captación de [18F]FMISO según el enfoque de captación de valor estandarizado (SUV).
Introduction
El carcinoma hepatocelular (CHC) es el sexto cáncer más diagnosticado y la tercera causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo, con más de 900.000 nuevos casos y 800.000 muertes en 20201. El principal factor de riesgo es la cirrosis, que ocurre como resultado de infecciones virales (virus de la hepatitis B y C), abuso de alcohol, diabetes y esteatohepatitis2 no alcohólica. El manejo del CHC es bastante complejo, y hay varias opciones de tratamiento disponibles, incluyendo resección quirúrgica, ablación térmica o química, trasplante, quimioembolización transarterial, radiación y quimioterapia, dependiendo de la estadificación de la enfermedad 2,3. El CHC es un tumor resistente a la quimioterapia con recidiva de la enfermedad en hasta 70 % de los pacientes después de la terapia con intención curativa2.
A pesar del alto grado de heterogeneidad tumoral, el CHC se asocia con dos resultados comunes: (i) el CHC es muy hipóxico, y (ii) la hipoxia tumoral está relacionada con una mayor agresividad tumoral y fracaso del tratamiento. La proliferación incontrolada de células HCC da como resultado una alta tasa de consumo de oxígeno que precede a la vascularización, creando así un microambiente hipóxico. Los niveles bajos de oxígeno intratumoral desencadenan una variedad de respuestas biológicas que influyen en la agresividad del tumor y la respuesta al tratamiento. Los factores inducibles por hipoxia (HIFs) son a menudo reconocidos como los reguladores transcripcionales esenciales en la respuesta a la hipoxia 2,3. Por lo tanto, la capacidad de detectar hipoxia es crucial para visualizar los tejidos neoplásicos e identificar los sitios inaccesibles, que requieren procedimientos invasivos. También ayuda a comprender mejor los cambios moleculares que conducen a la agresividad tumoral y mejorar los resultados del tratamiento del paciente.
Las imágenes moleculares mediante tomografía por emisión de positrones (TEP) se usan comúnmente en el diagnóstico y la estadificación de muchos cánceres, incluido el CHC. En particular, el uso combinado de imágenes PET de doble trazador que involucran [18 F]Fluorodesoxiglucosa ([18F]FDG) y [11C]Acetato puede aumentar significativamente la sensibilidad general en el diagnóstico de CHC 4,5. Las imágenes de hipoxia, por otro lado, se pueden lograr mediante el uso del marcador hipóxico de uso común [18 F] fluoromisonidazol ([18F] FMISO). En la práctica clínica, la evaluación no invasiva de la hipoxia es importante para diferenciar entre varios tipos de tumores y regiones para la planificación de la radioterapia6.
La imagen preclínica se ha convertido en una herramienta indispensable para la evaluación no invasiva y longitudinal de modelos de ratón para diferentes enfermedades. Un modelo de CHC robusto y altamente reproducible representa una plataforma importante para la investigación preclínica y traslacional sobre la fisiopatología del CHC humano y la evaluación de nuevas terapias. Junto con las imágenes PET, los comportamientos in vivo se pueden dilucidar para proporcionar información importante a nivel molecular para cualquier punto de tiempo dado. Aquí, describimos un protocolo para la generación de xenoinjertos de HCC ortotópicos de ligadura de la arteria hepática (HAL) y el análisis de su metabolismo tumoral in vivo utilizando [18 F]FMISO y [18F]FDG PET/MR. La incorporación de HAL hace un modelo adecuado de xenoinjertos de ratones HCC transgénicos o inducidos químicamente para estudiar la hipoxia tumoral in vivo, ya que HAL puede bloquear eficazmente el riego sanguíneo arterial para inducir hipoxia intratumoral 7,8. Además, a diferencia de la tinción inmunohistoquímica ex vivo con pimonidazol, los cambios en el metabolismo tumoral como resultado de la hipoxia pueden visualizarse fácilmente y cuantificarse con precisión de forma no invasiva utilizando imágenes PET, lo que permite la evaluación longitudinal de la respuesta al tratamiento o la medición de la aparición de resistencia 3,7,8 . Nuestro método que se muestra aquí permite la creación de un modelo robusto de HCC hipóxico junto con el monitoreo no invasivo de la hipoxia tumoral utilizando imágenes PET / MR para estudiar la biología del HCC in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, describimos los procedimientos para realizar HAL en xenoinjertos de HCC ortotópicos hepáticos con tumores subcutáneos, junto con métodos para la monitorización no invasiva de la hipoxia tumoral en xenoinjertos ortotópicos utilizando [18 F]FMISO y [18F]FDG PET/MR. Nuestro interés radica en la imagen metabólica de diversos modelos de cáncer y enfermedad para el diagnóstico precoz y la evaluación de la respuesta al tratamiento11,13,14,15<su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos el apoyo del Fondo Fiduciario contra el Cáncer de Hong Kong, el Fondo de Investigación Colaborativa del Consejo de Subvenciones de Investigación de Hong Kong (CRF C7018-14E) para los experimentos de imágenes de animales pequeños. También agradecemos el apoyo del Centro de Imágenes Moleculares y Ciclotrón Médico (MIMCC) de la Universidad de Hong Kong para la provisión de [18 F] FMISO y [18F] FDG.
Materials
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
Riferimenti
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