Ikke-invasiv PET/MR-avbildning i en ortotopisk musemodell av hepatocellulært karsinom

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å lage ortotopiske hepatocellulære karsinomxenotransplantater med og uten leverarterieligering og utføre ikke-invasiv positronemisjonstomografi (PET) avbildning av tumorhypoksi ved bruk av [18 F]Fluoromisonidazol ([18 F]FMISO) og [18 F]Fluorodeoksyglukose ([¹⁸F]FDG).

Abstract

Prekliniske eksperimentelle modeller av hepatocellulært karsinom (HCC) som rekapitulerer menneskelig sykdom representerer et viktig verktøy for å studere tumorigenese og evaluere nye terapeutiske tilnærminger. Ikke-invasiv avbildning av hele kroppen ved hjelp av positronemisjonstomografi (PET) gir kritisk innsikt i in vivo-egenskapene til vev på molekylært nivå i sanntid. Vi presenterer her en protokoll for ortotopisk HCC xenograftopprettelse med og uten leverarterieligering (HAL) for å indusere tumorhypoksi og vurdering av tumormetabolismen in vivo ved bruk av [18 F]Fluoromisonidazol ([18 F]FMISO) og [18 F]Fluorodeoksyglukose ([¹⁸F]FDG) PET/magnetisk resonans (MR) avbildning. Tumorhypoksi kunne lett visualiseres ved hjelp av hypoksimarkøren [18 F]FMISO, og det ble funnet at [18 F]FMISO-opptaket var høyere hos HCC-mus som gjennomgikk HAL enn i ikke-HAL-gruppen, mens [¹⁸F]FDG ikke kunne skille tumorhypoksi mellom de to gruppene. HAL-svulster viste også et høyere nivå av hypoksi-induserbar faktor (HIF)-1α-uttrykk som respons på hypoksi. Kvantifisering av HAL-svulster viste en 2,3 ganger økning i [¹⁸F] FMISO-opptak basert på standardisert verdiopptak (SUV) tilnærming.

Introduction

Hepatocellulært karsinom (HCC) er den sjette mest diagnostiserte kreftformen og den tredje vanligste dødsårsaken fra kreft på verdensbasis, med mer enn 900 000 nye tilfeller og 800 000 dødsfall i 2020¹. Den viktigste risikofaktoren er skrumplever, som oppstår som følge av virusinfeksjoner (hepatitt B- og C-virus), alkoholmisbruk, diabetes og ikke-alkoholisk steatohepatitt². Forvaltningen av HCC er ganske kompleks, og flere behandlingsalternativer er tilgjengelige, inkludert kirurgisk reseksjon, termisk eller kjemisk ablasjon, transplantasjon, transarteriell kjemoembolisering, stråling og kjemoterapi, avhengig av sykdomsstaging ^2,3. HCC er en kjemoterapi-refraktær svulst med sykdomsresidiv hos opptil 70% av pasientene etter kurativ intensjonsbehandling².

Til tross for den høye graden av tumorheterogenitet, er HCC forbundet med to vanlige utfall: (i) HCC er svært hypoksisk, og (ii) tumorhypoksi er knyttet til større tumoraggressivitet og behandlingssvikt. Den ukontrollerte spredningen av HCC-celler resulterer i et høyt oksygenforbruk som går foran vaskularisering, og skaper dermed et hypoksisk mikromiljø. Lave intratumorale oksygennivåer utløser deretter en rekke biologiske responser som påvirker tumoraggressivitet og behandlingsrespons. Hypoksi-induserbare faktorer (HIF) blir ofte anerkjent som de essensielle transkripsjonsregulatorene i responsen på hypoksi ^2,3. Derfor er evnen til å oppdage hypoksi avgjørende for å visualisere neoplastiske vev og identifisere de utilgjengelige stedene, som krever invasive prosedyrer. Det bidrar også til å bedre forstå de molekylære endringene som fører til tumoraggressivitet og forbedre pasientens behandlingsresultater.

Molekylær avbildning ved hjelp av positronutslippstomografi (PET) brukes ofte i diagnostisering og iscenesettelse av mange kreftformer, inkludert HCC. Spesielt kan kombinert bruk av dual-tracer PET-avbildning som involverer [18 F] fluorodeoksyglukose ([¹⁸F] FDG) og [¹¹C] acetat øke den totale følsomheten betydelig i HCC-diagnose ^4,5. Avbildning av hypoksi, derimot, kan oppnås ved å bruke den vanlige hypoksiske markøren [18 F]Fluoromisonidazol ([¹⁸F]FMISO). I klinisk praksis er ikke-invasiv vurdering av hypoksi viktig for å skille mellom ulike typer svulster og regioner for planlegging av strålebehandling⁶.

Preklinisk bildebehandling har blitt et uunnværlig verktøy for ikke-invasiv og langsgående evaluering av musemodeller for forskjellige sykdommer. En robust og svært reproduserbar HCC-modell representerer en viktig plattform for preklinisk og translasjonell forskning på patofysiologien til human HCC og vurdering av nye terapier. Sammen med PET-avbildning kan in vivo-oppførsel belyses for å gi viktig innsikt på molekylært nivå for et gitt tidspunkt. Her beskriver vi en protokoll for generering av hepatisk arterie ligering (HAL) ortotopiske HCC xenotransplantater og analyse av deres in vivo tumormetabolisme ved bruk av [18 F] FMISO og [¹⁸F] FDG PET / MR. Inkorporeringen av HAL gjør en egnet modell av transgene eller kjemisk induserte HCC-mus xenotransplantater for å studere tumorhypoksi in vivo, da HAL effektivt kan blokkere arteriell blodtilførsel for å indusere intratumoral hypoksi ^7,8. I tillegg, i motsetning til ex vivo immunhistokjemisk farging ved bruk av pimonidazol, kan endringer i tumormetabolisme som følge av hypoksi lett visualiseres og nøyaktig kvantifiseres ikke-invasivt ved hjelp av PET-avbildning, noe som muliggjør longitudinell vurdering av behandlingsrespons eller måling av resistensutvikling ^3,7,8 . Vår metode vist her gjør det mulig å lage en robust hypoksisk HCC-modell sammen med ikke-invasiv overvåking av tumorhypoksi ved hjelp av PET / MR-avbildning for å studere HCC-biologi in vivo.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med komiteen for bruk av levende dyr i undervisning og forskning (CULATR) i Senter for komparativ medisinforskning (CCMR) ved University of Hong Kong, et program akkreditert av Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Dyrene som ble brukt i studien var hunnmus med BALB/cAnN-nu (nakenmus) i alderen 6-8 uker, vektet til 20 g ± 2 g. Mat og vann ble gitt ad libitum. 1. Subkutan injeksjo…

Representative Results

For å oppnå en egnet tumorblokk for suksessiv ortotopisk implantasjon ble stabile kloner først generert ved subkutan injeksjon av 200 μL cellesuspensjon i DPBS (inneholdende MHCC97L-celler) i nedre flanke av nakne mus (figur 1A). Tumorvekst ble overvåket, og når tumorstørrelsen nådde 800-1000 mm 3 (ca. 4 uker etter injeksjon), ble mus avlivet, og den resulterende tumorblokken ble kuttet i ca. 1 mm3 fragmenter for påfølgende ortotopisk implantasjon i en annen g…

Discussion

I denne studien beskrev vi prosedyrene for å utføre HAL på leverortotopiske HCC-xenotransplantater ved bruk av subkutane svulster, sammen med metoder for ikke-invasiv overvåking av tumorhypoksi i ortotopiske xenotransplantater ved bruk av [18 F]FMISO og [¹⁸F]FDG PET/MR. Vår interesse ligger i metabolsk avbildning av ulike kreft- og sykdomsmodeller for tidlig diagnose og evaluering av behandlingsrespons^11,13,14,15<sup class="x…

Materials

0.9% sterile saline	BBraun	N/A	0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL
10# Scalpel blade	RWD Life Science Co.,ltd	S31010-01	Animal surgery tool
10% povidone-iodine solution	Banitore	6.425.678	For disinfection
25G needle with a 1 mL syringe	BD PrecisionGlide	N/A	1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections
5 mL syringe	Terumo	SS05L	5 mL syringe Luer Lock
70% Ethanol	Merck	1.07017	For disinfection
Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAF2000	For automated cell counting
Buprenorphine	HealthDirect	N/A	Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery
Cell Culture Dish (60 mm diameter)	Thermo Scientific	150462	For tumor tissue processing
Centrifuge	Sigma	3-16KL, fixed-angle rotor 12311	For cell suspensions collection
Centrifuge Conical Tube	Eppendorf	EP0030122151	For cell suspensions collection
Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)	Gibco	10566024	high glucose, GlutaMAX™ Supplement
Digital Caliper	RS PRO	841-2518	For subcutaneous tumor size measurement
Direct heat CO2 incubator	Techcomp Limited	NU5841	For cell culture
Dose calibrator	Biodex	N/A	Atomlab 500
DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline)	Gibco	14287072	For cell wash and injection
Eye lubricant	Alcon Duratears	N/A	Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	A4766801	Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines
Forceps (curved fine and straight blunt)	RWD Life Science Co.,ltd	F12012-10 & F12011-13	Animal surgery tool
Heating pad	ALA Scientific Instruments	N/A	Heat pad for mice during surgery
Insulin syringe	Terumo	10ME2913	1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections
InterView fusion software	Mediso	Version 3.03	Post-processing and image analysis software
Inverted microscope	Yu Lung Scientific Co., Ltd	BM-209G	For cells morphology visualization
Isoflurane	Chanelle Pharma	N/A	Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL
Ketamine	Alfasan International B.V.	HK-37715	Ketamine 10% injection solution, 10 mL
Medical oxygen	Linde HKO	101-HR	compressed gas, 99.5% purity
nanoScan PET/MR Scanner	Mediso	N/A	3 Tesla MR
Needle holder	RWD Life Science Co.,ltd	F31026-12	Animal surgery tool
Nucline nanoScan software	Mediso	Version 3.0	Scanner operating software
Nylon Suture (6/0 and 5/0)	Healthy Medical Company Ltd	000524 & 000526	Animal surgery tool
Penicillin- Streptomycin	Gibco	15140122	Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin.
Pentabarbital	AlfaMedic	13003	Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice
Sharp scissors	RWD Life Science Co.,ltd	S14014-10	Animal surgery tool
Spring Scissors	RWD Life Science Co.,ltd	S11005-09	Animal surgery tool
Trypan Blue Solution, 0,4%	Gibco	15250061	For cell counting
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red.	Gibco	25200072	For cell digestion
Xylazine	Alfasan International B.V.	HK-56179	Xylazine 2% injection solution, 30 mL