Medicine

成年小鼠视网膜的视网膜外植体作为研究视网膜神经血管疾病的离体模型

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63966

Khaled Elmasry^1,2,3, Mohamed Moustafa^1,2, Mohamed Al-Shabrawey^1,2

¹Eye Research Center and Department of Foundational Medical Studies, Oakland University William Beaumont School of Medicine, ²Eye Research Institute, Oakland University, ³Human Anatomy and Embryology Department, Mansoura Faculty of Medicine, Mansoura University

Summary

该协议介绍并描述了从成年小鼠获得的视网膜外植体的分离，解剖，培养和染色的步骤。该方法作为研究不同视网膜神经血管疾病（如糖尿病视网膜病变）的离体模型是有益的。

Abstract

视网膜研究的挑战之一是研究不同视网膜细胞（如视网膜神经元、神经胶质细胞和血管细胞）之间的串扰。 体外分离 、培养和维持视网膜神经元具有技术和生物学局限性。培养视网膜外植体可以克服这些限制，并提供独特的离体模型来研究具有良好控制生化参数且独立于血管系统的各种视网膜细胞之间的串扰。此外，视网膜外植体是研究各种视网膜血管和神经退行性疾病（如糖尿病视网膜病变）的新型药物干预的有效筛选工具。在这里，我们描述了视网膜外植体长期分离和培养的详细方案。手稿还介绍了在此过程中的一些技术问题，这些问题可能会影响视网膜外植体培养的预期结果和可重复性。视网膜外植体培养开始2周后，视网膜血管、神经胶质细胞和神经元的免疫染色显示视网膜毛细血管和神经胶质细胞完整。这使视网膜外植体成为在模拟糖尿病视网膜病变等视网膜疾病的条件下研究视网膜血管系统和神经胶质细胞变化的可靠工具。

Introduction

已经提出了不同的模型来研究视网膜疾病，包括体内和体外模型。动物在研究中的使用仍然是一个持续的伦理和转化辩论问题¹。涉及小鼠或大鼠等啮齿动物的动物模型通常用于视网膜研究²，³^，⁴。然而，由于啮齿动物视网膜与人类不同的生理功能，例如黄斑缺失^或色觉差异5，因此出现了临床问题。使用人类死后眼睛进行视网膜研究也存在许多问题，包括但不限于原始样本的遗传背景、捐赠者的病史以及捐赠者以前的环境或生活方式的差异⁶.此外，在视网膜研究中使用体外模型也有一些缺点。用于研究视网膜疾病的细胞培养模型包括利用人源细胞系、原代细胞或干细胞⁷。所使用的细胞培养模型已被证明在被污染、错误识别或去分化方面存在问题⁸，⁹，¹⁰^，¹¹。最近，视网膜类器官技术取得了重大进展。然而，体外构建高度复杂的视网膜有几个局限性。例如，视网膜类器官不具有与成熟的体内视网膜相同的生理和生化特征。为了克服这一限制，视网膜类器官技术必须整合更多的生物和细胞特征，包括平滑肌细胞、脉管系统和免疫细胞，如小胶质细胞¹²，¹³^，¹⁴^，¹⁵。

器官型视网膜外植体已成为研究糖尿病视网膜病变和退行性视网膜疾病等视网膜疾病的可靠工具¹⁶，¹⁷，¹⁸^，¹⁹。与其他现有技术相比，视网膜外植体的使用通过添加独特的功能来研究相同生化参数下各种视网膜细胞之间的串扰，并且独立于系统变量，从而支持体外视网膜细胞培养和当前的体内动物模型。外植体培养物允许不同的视网膜细胞在同一环境中保持在一起，从而可以保存视网膜细胞间的相互作用^20，21^，²²。此外，先前的一项研究表明，视网膜外植体能够保留培养的视网膜细胞的形态结构和功能²³。因此，视网膜外植体可以为研究各种视网膜疾病的可能治疗靶点提供一个体面的平台²⁴，²⁵^，²⁶。视网膜外植体培养提供了一种可控的技术，并且非常灵活地替代了允许多种药理学操作并可以揭示多种分子机制的现有蛾体²⁷。

本文的总体目标是将视网膜外植体技术作为体外细胞培养和体内动物模型之间的合理中间模型系统。这种技术可以比解离细胞更好地模仿视网膜功能。由于各种视网膜层保持完整，视网膜细胞间相互作用可以在实验室中在控制良好的生化条件下进行评估，并且独立于血管系统功能²⁸。

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Protocol

所有动物实验均由美国密歇根州罗切斯特奥克兰大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并遵循视觉和眼科研究协会（ARVO）关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明制定的指南。

1. 动物制备

将动物饲养在光照受控的环境中，温度恒定。动物宿舍的温度设置应遵循《实验动物护理和使用指南》的指引。小鼠的温度范围在18°C至26°C之间。保持湿度水平控制并设置在42%左右。
对于该实验，使用超过12周龄的雄性C57BL / 6J小鼠（有关详细信息 ，请查看材料表 ）（该协议使用成年小鼠）。
注意：该协议中使用了野生型菌株进行演示，因为它没有任何影响视网膜的遗传异常。然而，人们可以使用其他菌株，包括遗传操纵菌株，用于视网膜外植体培养。
通过动物饲养室的照明控制提供 12 小时的光照/黑暗循环。
每周两次检查每只动物的健康状况以及足够的食物和水摄入量，周末每天检查一次。确保为他们提供新鲜的食物和干净的水。
如果一周内食物和水位较低，请冲洗水瓶并重新装满。在需要时添加新鲜食物。每天或根据需要更换脏笼子，以保持动物的健康。
注意：为了研究视网膜的光感受器和光诱导的变化，请在位于动物设施暗室的特殊暗盒中对小鼠进行过夜的黑暗适应。
在连接到CO 2室的钢瓶中使用压缩的CO 2气体，通过CO₂吸入过量对家中笼子中的动物实施安乐死。使用安乐死的次要方法（例如颈椎脱位）进行死亡确认。
完成手术后，通过适当的方法确认动物死亡，例如确认心脏和呼吸骤停或观察动物的固定和散大瞳孔。

2. 组织准备

动物被安乐死后，用 70% 乙醇清洁该区域。然后，用一只手打开眼睑，使眼睛可见。用弯曲的镊子用另一只手对眼眶的上部和下部施加压力，直到眼球突出。
要去除眼睛，请轻轻关闭眼睛后部的镊子，然后连续抬高。使用镊子，将眼球从视神经上握住。确保在所有步骤中使用无菌解剖工具，并在完全无菌条件下工作。
将每个眼球浸入含有 1 mL 冰冷 HBSS 和青霉素链霉素（10，000 U/mL）的 1.5 mL 管中。在HBSS中清洗眼球两次，每次5分钟。
将眼球转移到含有完整培养基（10% FBS、2% B27、1% N2、1% L-谷氨酰胺和 1% 青霉素和链霉素）的 1.5-2 mL 管中。

3. 组织解剖

在手术显微镜下仔细解剖视网膜，如图 1所示。
1. 在视缘周围做一个圆周切口以打开眼球。通过沿角膜边界和（角膜缘）切口圆形解剖来切除角膜，然后切除前段、晶状体和玻璃体，留下一个空的眼罩。
2. 用细镊子握住视神经头区域，轻轻剥下眼睛的外层。在去除外层时要格外小心，以免伤害神经视网膜并确保视网膜保持完全完整。
  注意：必须小心地将视网膜从视网膜色素上皮（RPE）上剥离，并且必须在视神经头上进行单次切割以将视网膜与视神经分离。通过识别视神经（视神经头）留下的孔来目视确保这一点。
3. 放射状解剖视网膜，分成四个大小相等的碎片。
请按照以下步骤处理视网膜的小块，以确保视网膜培养的正确方向。
1. 使用解剖剪刀刀片，在视网膜片下方打开（材料表）。
2. 用打开的剪刀刀片的尖端慢慢提起视网膜片，然后将其轻轻转移到培养板上。
将来自分离的视网膜的外植体分别转移到 12 孔板中的细胞培养插入物上，每个板含有 300 μL 视网膜外植体培养基，视网膜神经节细胞（神经视网膜）面朝上。
注：确保介质是带有 N2 和 B27 补充剂的 DMEM 介质。将青霉素-链霉素（10，000 U/mL）也添加到培养基中（材料表）。视网膜由多层神经元细胞组成，通过突触相互连接，并由视网膜色素上皮的色素层从外部支撑，这是在解剖过程中去除的黑色层。
去除色素上皮的任何残留物;然而，这些残留物可以帮助识别外植体的正确方向。确保着色部分朝下，非着色部分朝上。
将视网膜外植体培养物在37°C和5%CO₂的加湿培养箱中孵育。
确保视网膜表面朝上。如果视网膜片翻转或折叠，请尝试将其轻轻调整到正确的方向。
注意：要特别注意培养板中视网膜外植体的正确方向。避免培养板中外植体的任何翻转或折叠，因为这会导致培养中视网膜细胞的正常生长失败。

4. 视网膜外植体培养

将视网膜外植体培养物（在步骤3.2-3.3中制备）保持在37°C和5%CO₂的加湿培养箱中。
每隔一天更换每个孔的一半培养基，持续 2 周。为此，请小心地从孔中移取 150 μL。然后，将 150 μL 新鲜培养基重新加入孔中。更换培养基时避免翻转外植体。
在将培养板放回培养箱之前，在显微镜下仔细检查外植体。在明场显微镜下检查细胞和视网膜结构的完整性。确保外植体的方向仍然正确。使用4倍和20倍物镜检查外植体。
注意：避免外植体完全浸入培养基中。

5. 免疫组化

2周后，通过去除培养基来固定视网膜外植体。为此，首先用 200 μL 1x PBS 洗涤一次，然后将 300 μL 4% 多聚甲醛加入 0.1 M PBS（pH 7.4）中，加入包含外植体的孔中并放置过夜。
注意：此步骤无需从平板上取下培养物插入物即可完成。外植体也可以转移到500μL锥形管中，洗涤和固定可以在管内完成。
将外植体转移到含有 300 μL 1x PBS-2.5% Triton X 的 500 μL 锥形管中进行洗涤。
在摇床（25rpm）上使用中等速度洗涤管中的固定外植体三次，每次5分钟。
在抗体孵育前，将外植体与含有0.02%硫柳汞的300μL1x封闭缓冲液在室温下孵育1小时，从而阻断预期的非特异性反应。
在摇床上使用中等速度将固定的外植体与一抗在4°C孵育过夜。
注意：通过用GSL I，BSL I抗体（凝集素）染色（7：1，000）检测固定外植体中的视网膜内皮细胞。通过用兔神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）抗体（GFAP）染色来检测视网膜外植体中的神经胶质细胞（1：250）。通过用兔NeuN抗体（1：250）染色外植体来检测视网膜神经元²⁹^，³⁰。孵化s{Tual-Chalot， 2013 #117}{Tual-Chalot， 2013 #116}{Tual-Chalot， 2013 #116}组外植体与凝集素，NeuN组合，并用凝集素，GFAP组合孵育其他。
第二天，用移液管抽吸从试管中取出一抗。用1x PBS-2.5%Triton X洗涤外植体三次，每次5分钟，在摇床上以中等速度。
添加二抗：山羊抗兔IgG（1：500）（GFAP和NeuN的次要）和德克萨斯红（7：1，000）（凝集素）。在室温下在摇床上使用中等速度孵育1小时。
注意：二抗对光敏感，因此请用铝箔覆盖试管。
通过抽吸除去二抗，然后用1x PBS-2.5%Triton X洗涤三次，每次5分钟。
使用移液管将外植体从管转移到载玻片上。去除载玻片上多余的液体，然后将一滴带有DAPI的封片介质添加到载玻片中。
用盖玻片盖住纸巾。盖玻片和组织之间不允许有任何气泡。
将染色的载玻片带到荧光显微镜下，然后开始拍摄图像。使用载玻片盒覆盖染色玻片很重要，因为荧光染色是光敏的。

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Representative Results

视网膜外植体的神经元和血管视网膜细胞在体外培养基中长时间存活
通过使用我们的方案培养视网膜外植体，我们成功地维持了不同的视网膜细胞，这些细胞存活长达 2 周。为了验证不同视网膜细胞的存在，使用神经元细胞标志物（NeuN），神经胶质细胞标志物（GFAP）和血管标志物（异凝集素-B4）对视网膜外植体进行了免疫荧光染色（图2）。染色显示组织良好且发育良好的视网膜神经元和神经胶质细胞。此外，视网膜血管结构完整，如异凝集素-B4染色所示。如免疫染色所示，视网膜外植体的形态完整性表明，视网膜外植体培养成功地维持了可作为实验模型的活视网膜细胞。使用外植体研究的不同实验条件可以通过使用 ImageJ 软件对多个细胞标记物进行免疫荧光染色来评估和分析。免疫染色允许测量各种实验组中每个细胞标志物的免疫反应水平和特定细胞的数量，例如视网膜神经节细胞或光感受器的数量。

培养板中视网膜外植体的正确定向对实验结果的重要性
培养板中视网膜外植体的正确方向是通过将神经视网膜朝上孵育来实现的。另一方面，视网膜外植体的衰竭可能是由于翻转或折叠视网膜组织，这会导致神经视网膜朝下。2周后使用不同的视网膜标志物（NeuN，GFAP和异凝集素-B4）对培养的视网膜外植体进行免疫荧光染色，表明正确的外植体定向失败导致神经血管元件的正常发育失败（图3）。

图1：解剖眼球以产生视网膜外植体的步骤。（a）去核眼球从动物身上取出后立即浸入培养基中。（b）沿角膜缘做一个圆周切口以打开眼球。（c）通过沿角膜缘切口解剖来切除角膜。（d）用细镊子握住视神经，轻轻剥去眼睛的外层。（e）晶状体、玻璃体和睫状体被切除。（F）只留下神经视网膜。（g）在视网膜上切开四个径向切口，以便在下一步中切开视网膜。（h）视网膜可以切成两块或四块，然后转移到包含插入物和培养基的细胞培养板上。请点击此处查看此图的大图。

图2：成功的视网膜外植体培养，保留视网膜结构。对在培养中停留2周的视网膜外植体进行免疫荧光染色。将外植体固定并用（a）NeuN（绿色）和血管异凝集素-B4（红色）染色，（b）神经胶质细胞GFAP（绿色）和血管异凝集素B4（红色）。染色显示发育良好的视网膜细胞和视网膜血管。比例尺 = 50 μm。请点击此处查看此图的大图。

图3：视网膜外植体培养失败，视网膜细胞有缺陷，发育不足。在培养中停留两周的视网膜外植体的免疫荧光染色。将外植体固定并用GFAP染色用于神经胶质细胞（绿色）和异隔离凝集素-B4用于血管（红色）。图像显示染色缺陷和视网膜细胞和视网膜血管发育不足。视网膜外植体折叠，在培养板中方向不正确。应特别注意确保视网膜朝上时外植体的正确方向。未能将视网膜外植体置于正确的方向将导致外植体的正常发育失败。比例尺 = 100 μm 请点击此处查看此图的大图。

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Discussion

我们的实验室一直在研究促进视网膜微血管功能障碍的病理生理变化^31，32，³³，^34，35^，³⁶年。视网膜外植体是可以用作研究视网膜疾病（如糖尿病视网膜病变或退行性视网膜疾病）的模型的技术之一。具有来自与治疗组或组相同的单个视网膜或动物的对照组，使该技术在提供不同实验条件的更可靠比较方面具有很大的优势。

视网膜外植体制备过程中的主要挑战之一是外植体折叠或培养板中的错误方向，视网膜表面朝下。其他研究人员建议在移液管内上下移液视网膜，使其在板³⁷中处于正确的方向。然而，在他们的方案中，他们将整个视网膜用于单个外植体，但在这个协议中，单个视网膜被切成两到四块，这意味着这些碎片更小，并且很难进行这种操作以获得正确的方向。将单个视网膜切割成两到四块可以从可用于实验的同一动物那里获得四到八个视网膜碎片。这允许对照组和实验组来自同一动物的实验。

然而，将视网膜切成小块会使它的处理更具挑战性。因此，我们开发了一种处理这些小视网膜碎片的技术，以确保视网膜培养的正确方向。为此，将打开的解剖剪刀刀片放置在视网膜片下方，视网膜表面朝上。如果将视网膜片翻转或折叠，则会将其轻轻调整到正确的方向。慢慢地，用打开的剪刀刀片的尖端抬高视网膜片，并轻轻放入培养板中。这种简单的技术可确保每个视网膜切片的方向正确，视网膜朝上，并促进研究视网膜血管和神经胶质细胞的更好结果（图2）。未能将视网膜外植体放置在正确的方向，神经视网膜朝上将导致培养物中视网膜细胞的正常生长失败，如图 3所示。强烈建议进行适当的培训以避免此技术错误。

该协议描述了成年小鼠视网膜的器官型视网膜外植体;然而，该技术以前也曾被描述用于未成熟的小鼠视网膜³⁷和人类视网膜³⁸。在之前的一项研究中，描述了视网膜外植体培养物用于研究血管发育，其中内皮功能操作在离体27中变得可行。作为视网膜外植体形态学评估的一个例子，将视网膜外植体培养2周，然后使用NeuN（神经元细胞标志物），GFAP（神经胶质细胞标志物）和异凝集素-B4（血管标志物）进行免疫染色。染色显示视网膜细胞和血管发育良好，在外植体中保存完好（图2）。然而，可以获得更多的免疫组织化学染色数据来检查外植体中其他视网膜细胞的活力和功能。

外植体培养本身可能对视网膜细胞造成压力。然而，细胞可以在相对正常的条件下孵育，以便将各种实验条件下发生的形态变化（例如高血糖或缺氧）与基线条件进行比较。因此，外植体是评估各种视网膜细胞并在各种视网膜疾病中同时测试它们对不同药物或治疗靶点的反应的良好工具。

视网膜新生血管形成是缺血性视网膜病变的主要体征，例如早产儿视网膜病变和糖尿病视网膜病变。我们（图2）和其他²⁷，³⁹^，⁴⁰，⁴¹^，⁴²可以在培养的外植体中观察到完整的视网膜脉管系统长达2周。因此，视网膜外植体已被用于研究正常和病理性视网膜新生血管的病理生理学41，42，43，44，⁴⁵，46，47，⁴⁸^，⁴⁹。有趣的是，一个研究小组记录了VEGF诱导的小鼠视网膜外植体血管萌芽，同时研究了增殖性糖尿病视网膜病变中升高的促血管生成因子⁴³。此外，视网膜外植体已嵌入三维凝胶中，允许以更详细的时空方向研究视网膜内皮细胞的发芽⁴⁵，⁴⁶^，⁴⁷。

除了形态学研究外，视网膜外植体也在一定程度上用于评估视网膜功能⁵⁰，⁵¹，⁵²^，⁵³。离体视网膜电图（ERG）成像已在分离的小鼠视网膜外植体上进行，允许研究各种视网膜细胞的不同功能，包括视杆细胞和视锥光感受器⁵⁴，⁵⁵，⁵⁶^，⁵⁷。有趣的是，Calbiague等人报告说，响应于高葡萄糖治疗，来自小鼠或大鼠的视网膜外植体培养物显示出视网膜层厚度逐渐减少⁵⁸。然而，视网膜双极细胞是糖尿病病症最早的敏感细胞之一，不仅在培养中保持其形态，而且在培养中保持电生理特性长达2周⁵⁸。总之，我们认为该协议可以作为未来其他研究的基础或起点，以优化外植体在眼科研究中的益处。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们要感谢美国国立卫生研究院（NIH）向国家眼科研究所（R01 EY030054）提供的资助，感谢Mohamed Al-Shabrawey博士。我们要感谢Kathy Wolosiewicz帮助我们进行视频解说。我们要感谢奥克兰大学眼科研究所儿科视网膜研究实验室的Ken Mitton博士在使用手术显微镜和记录期间提供的帮助。该视频由Khaled Elmasry博士编辑和导演。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult C57Bl/6J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA	664
All-in-One Fluorescence Microscope	KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A.	BZ-X800
B27 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17504-04
Blockade blocking solution	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	B10710
DMEM F12	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG.	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin)	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades	World Precision Instruments,FL 34240, USA	Straight (503365)
N2 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	140652
Paraformaldehyde 4% in PBS	BBP, Ashland, MA, 01721 USA	C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody	Abcam.,Cambridge, UK	ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody	Dako,Carpinteria, CA 93013, USA.	Z0334
Texas Red	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	SA-5006-1
TritonX	BioRad Hercules, CA, 94547,USA	1610407