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Neuroscience

自由移动小鼠中肠道来源的微生物代谢物的脑室内递送

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63972
Automatic Translation
*1,2, *2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine, National Cheng Kung University
* These authors contributed equally

Summary

肠道来源的微生物代谢物具有多方面的作用，导致动物的复杂行为。我们的目标是提供一种循序渐进的方法，通过引导套管通过脑室内输送来描述肠道来源的微生物代谢物在大脑中的作用。

Abstract

肠道微生物群及其代谢物对宿主生理和行为的影响在这十年中得到了广泛的研究。大量研究表明，肠道微生物群衍生的代谢物通过宿主中复杂的肠脑通路调节大脑介导的生理功能。短链脂肪酸（SCFA）是肠道微生物组在膳食纤维发酵过程中产生的主要细菌衍生代谢物。来自肠道的分泌的SCFA可以在外周的多个部位起作用，由于SCFAs受体的广泛分布，影响免疫，内分泌和神经反应。因此，通过口服和腹膜内给药来区分SCFAs的中枢效应和外周效应具有挑战性。本文提出了一种基于视频的方法，通过引导套管在自由移动的小鼠中询问SCFAs 在 大脑中的功能作用。大脑中SCFA的数量和类型可以通过控制输注量和速率来调节。这种方法可以为科学家提供一种方法来了解肠道衍生代谢物在大脑中的作用。

Introduction

人体胃肠道含有影响宿主的各种微生物1，2，3。这些肠道细菌在利用宿主消耗的膳食成分时可以分泌肠道衍生的代谢物4，5。有趣的是，未在外周代谢的肠道代谢物可以通过循环转运到其他器官6。值得注意的是，这些分泌的代谢物可以作为肠脑轴的介质，定义为中枢神经系统和肠道之间的双向通信7。先前的研究表明，肠道衍生的代谢物可以调节动物的复杂行为和情绪8，9，10，11。

短链脂肪酸（SCFAs）是肠道微生物群在膳食纤维和难消化碳水化合物发酵过程中产生的主要代谢物6。乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐是肠道中含量最高的 SCFAs12。SCFA是胃肠道细胞的能量来源。肠道中未代谢的SCFA可以通过门静脉运输到大脑，从而调节大脑和行为6，12。先前的研究表明，SCFA可能在神经精神疾病中起关键作用6，12。例如，在自闭症谱系障碍（ASD）的动物模型BTBR T+ Itpr3tf / J（BTBR）小鼠中腹腔注射丁酸盐挽救了他们的社会缺陷13。接受来自抑郁受试者微生物群的抗生素处理的大鼠显示出焦虑样行为和粪便SCFAs的增加14。临床上，与通常的对照组相比，在ASD患者中观察到粪便SCFAs水平的变化15，16。抑郁症患者的粪便SCFAs水平低于健康受试者17，18。这些研究表明，SCFAs可以通过各种途径改变动物和人类的行为。

微生物代谢物对体内多个部位产生多种影响，影响宿主生理和行为4，19，包括胃肠道、迷走神经和交感神经。当通过外周途径施用代谢物时，很难确定肠道来源代谢物在大脑中的确切作用。本文提出了一种基于视频的方案，用于研究肠道衍生代谢物对自由移动的小鼠大脑的影响（图1）。我们发现，在行为测试期间，可以通过引导套管急性给予SCFA。代谢物的类型、体积和输注速率可以根据目的进行修改。可以调整插管部位，以探索肠道代谢物在特定大脑区域的影响。我们的目标是为科学家提供一种方法来探索肠道来源的微生物代谢物对大脑和行为的潜在影响。

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Protocol

所有实验方案和动物护理均已获得国立成功大学（NCKU）机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1.实验动物的准备

  1. 从供应商处获得6-8周龄的野生型C57BL / 6JNarl雄性小鼠。
  2. 将小鼠饲养在标准小鼠笼中，用标准老鼠食物和 随意消毒的水。
    注意：NCKU实验动物中心的外壳条件为22±1°C温度，55%±10%湿度和13小时/ 11小时亮/暗循环。

2. 立体定位手术

  1. 准备和消毒立体定位器械、手术器械和相关物品。
    注意：所有直接接触手术部位的物品都应消毒以避免感染。
  2. 通过将小鼠置于Plexiglas笼中用1%-5%异氟醚在氧气中麻醉小鼠。
    注意：密切观察鼠标以确保呼吸频率保持在每秒一次呼吸左右。
  3. 将鼠标取出麻醉室。用宠物修剪器剃除手术部位（小鼠头部）。通过将鼠标门牙固定在立体定位门牙支架中的门牙杆上，将鼠标放在立体定位框架上。用鼻锥面罩遮住鼻子。
  4. 在整个立体定位手术中用1%-2.5%异氟醚在氧气中麻醉小鼠。通过脚趾捏反射 评估 小鼠的伤害感受，并确保在切开手术部位之前保持恒定的呼吸频率。
  5. 在立体定位框架上的鼠标下方放置加热垫（37.0°C），以在手术过程中保持体温。或者，借助连接程序加热器和加热垫的直肠热探头保持核心温度。
  6. 用胶带去除头上修剪过的皮毛。皮下注射镇痛药酮洛芬（5mg / kg）以缓解疼痛。涂抹眼膏以避免眼睛干涩。
  7. 将尖头插入耳道以固定头部。
  8. 通过调整耳杆的比例使头部居中。
  9. 拧紧门牙支架上的鼻夹，避免垂直移动。轻轻按压头部以检查头部是否固定，并避免头部在随后的手术中变得松动。
  10. 使用棉签对头皮进行三次氯己定交替擦洗。从中间到外侧（从消毒最严格的中心区域到消毒最少的区域）开始每次擦洗。
    注意：从中间到外部使用磨砂膏可以帮助科学家最大限度地减少毛皮的感染和污染。外部区域靠近未剃光头的区域，那里仍然有大量的皮毛，不容易彻底消毒。
  11. 使用手术刀片以前/后方式（<1 cm）切开头皮。打开切口，用显微解剖钳握住的棉签擦拭头骨。
    注意：显微解剖钳、手术刀片和棉签必须在手术前通过高压灭菌进行灭菌。在手术过程中，在每只动物前后使用玻璃珠灭菌器（150°C）对所有手术设备进行至少5秒的消毒。准备一个消毒的烧杯，以便在手术过程中和动物之间固定手术刀片和镊子。
  12. 识别头骨上的布雷格玛和 Lambda。使用 Bregma 作为参考来定位感兴趣区域。
    1. 可选：将立体定位钻头安装在立体定位钻架上，并使用钻头的尖端将 Bregma 作为参考。使用玻璃珠灭菌器（150°C）对立体定位钻头进行灭菌至少5秒。
  13. 通过Bregma/Lambda在左/右和前/后平面上校准和对齐扁平头骨水平面。
    注意：如果不在正确的水平面上，请将鼠标重新安装在立体定位仪器上。

3.商业定制导引套管植入

  1. 根据立体定位坐标识别并标记右外侧心室的位置：到前/后（A / P）的距：0.26 mm，内侧/外侧（M / L）：-1.0 mm，背侧/腹侧（D / V）：-2.0 mm20。
    注意：可以根据感兴趣的区域修改坐标。侧脑室的坐标基于体重范围为26-30g的成年C57BL / 6J小鼠。如果使用较年轻的小鼠，请参阅讨论。
  2. 使用立体定位钻头在标记部位的颅骨上钻一个孔（直径 = 1.5 mm），以植入商业引导套管。
  3. 使用立体定位钻头在颅骨上再钻两到四个孔（直径 = 1.5 毫米），以安装不锈钢螺钉。
    注意：在每只动物之前和之后，使用玻璃珠灭菌器（150°C）对立体定位钻头进行至少5秒的消毒。
  4. 擦拭骨屑并用棉签止血。
  5. 用棉签用利多卡因（1 mg / kg）擦拭头骨，以获得局部麻醉，止痒和止痛效果。如果钻孔后出血没有停止，请轻轻地将棉签放在孔上止血。
  6. 在孔上安装两到四个不锈钢螺钉，为牙科丙烯酸提供锚。
  7. 将商业引导套管放在立体定位套管支架上，并用玻璃珠灭菌器（150°C）消毒。
    注意：商用导向套管、商用假人和商用喷油器（图 2A）是按照 材料表中显示的规格定制的。
  8. 将立体定向套管支架移动到为侧心室钻孔的孔中，然后将商业导向套管缓慢插入孔中，直到所需的深度（2.5 mm）。
    注意：当尖端几乎没有插入孔中时，可以通过将商业导引套管的尖端设置为参考来定义背/腹坐标。
  9. 应用 10 μL 氰基丙烯酸正丁酯粘合剂（组织粘合剂胶）将商业导向套管固定在钻孔中并等待 3-4 分钟。从立体定位套管支架上轻轻松开商业导向套管，然后将支架移开。
  10. 将牙科丙烯酸涂抹在切开的头皮上以固定商业导引套管并等待至少 5 分钟。将商业假人植入商业导引套管中，以避免套管被血液或体液堵塞（图2B）。
  11. 从耳道上松开耳杆，然后将鼠标从立体定位框架中取出。
  12. 将鼠标放入一个新的笼子中，下面有一个加热垫，以便从麻醉中恢复过来，并持续观察直到鼠标完全醒来。
    注意：在动物恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前，不要让动物无人看管。接受手术的动物在完全康复之前不应回到其他动物的陪伴下。
  13. 将鼠标返回到单个住房或组住房，具体取决于机构IACUC协议和实验设计。对于集体住房，确保将较少的小鼠饲养在笼子中，以尽量减少不必要的伤害或套管的脱离。
  14. 在饮用水中给予布洛芬 （0.2 mg/mL） 至少 3 天进行术后护理，每天监测两次疼痛和痛苦迹象至少 3 天。
    1. 在术后护理期间，在皮肤周围涂抹罗红霉素软膏，以防止小鼠发炎和感染。
    2. 继续监测动物的状态，并及时腹腔注射5%葡萄糖和/或0.9%氯化钠以提供足够的能量。
    3. 如果疼痛，痛苦或感染状态稳步恶化，则通过吸入CO2 对小鼠实施安乐死。
  15. 手术后等待1周，以使小鼠准备好进行SCFA的脑室内递送和行为测试。

4. SCFA的准备

  1. 将乙酸钠，丁酸钠和丙酸钠溶解在人工脑脊液（ACSF）中（见 材料表）。
  2. 确保化学物质完全溶解，然后将pH调节至7.4，并通过0.22μm过滤器过滤SCFAs混合物进行灭菌。

5.在行为测试期间建立脑室内递送SCFA的输液系统

  1. 安装天花板摄像头以记录行为。将相机与计算机连接以控制视频录制软件（图3）。
  2. 用蒸馏水填充 10 μL 注射器。
    注意：避免微升注射器中的气泡。
  3. 将显微注射泵与显微注射控制器连接。
  4. 将微升注射器安装在显微注射泵上。要安装注射器，请按下按钮松开夹子并将注射器安装到相应位置。关闭夹子并拧紧显微注射泵上的柱塞固定螺钉（图4A）。
  5. 将商用注射器插入聚乙烯管（图2A）。
  6. 将聚乙烯管挂在测试场上方的天花板摄像头上。
  7. 使用胰岛素注射器用蒸馏水填充聚乙烯管。将微升注射器连接到悬挂的聚乙烯管。
    注意：确保聚乙烯管足够长，以允许鼠标在整个测试领域自由移动。

6. 显微注射控制器的系统设置

  1. 打开显微注射控制器，然后按显示所有通道以访问命令屏幕（图4C）。按配置并将体积目标设置为 9，800 nL，输送速率为 100 nL/s。从连接到微升注射器的聚乙烯管中注入 9，800 nL 蒸馏水（按方向切换到注入模式并按 RUN）（参见图 4C 命令屏幕中的红色方块）。
  2. 按配置并将体积目标设置为 3，000 nL，输送速率为 100 nL/s。提取 3，000 nL 矿物油（按“方向”切换到“提取”模式，然后按 RUN）（请参阅图 4C 命令屏幕中的红色方块）。
    注意：聚乙烯管上应观察到清晰的油水相分离。
  3. 从微升注射器针头上拆卸聚乙烯管。从微升注射器针头中吐出 3，000 nL 蒸馏水（按 方向 切换到 注入 模式并按 RUN）。
  4. 将微升注射器插回聚乙烯管中。按配置并将体积目标设置为 9，500 nL，输送速率为 100 nL/s。提取 9，500 nL 的 SCFA（按方向切换到提取模式并按 RUN）。标记油-SCFAs相以验证SCFAs是否成功注入。
  5. 按配置并将所需的体积目标（输送速率）设置为 7 nL/s。按方向切换到注入模式（参见图 4C 命令屏幕中的红色方块）。
    注意：根据输注时间确定体积。例如，如果输注时间为3分钟，输送速率为7 nL / s，则目标体积= 1，260 nL。
  6. 按 RUN 向前注入微升注射器，直到液体从商业注射器的前端流出，然后将注射器插入套管以进行 SCFA 注射。

7.在自由移动的小鼠中，通过商业引导套管将SCFA输注到侧脑室

  1. 通过将小鼠置于Plexiglas笼中用1%-5%异氟醚在氧气中麻醉小鼠。
    注意：密切观察鼠标以确保呼吸频率保持在每秒一次呼吸左右。
  2. 擦拭鼠标并将商用注射器插入商业导向套管（图4B）。
    注意：如果商业导引套管被血液或体液堵塞，请用镊子轻轻疏通。
  3. 在行为测试之前，让小鼠在笼子中从麻醉中恢复15分钟。
  4. 对于基本的运动测试，将鼠标放在一个新的笼子中，让它自由探索35分钟。在前 5 分钟内，目标体积为 2，100 nL 的递送速率为 7 nL/s 的注入 SCFA（按方向进入注入模式并按 RUN）。
    注意：可以使用动物行为视频跟踪软件21，22分析新型笼子中的运动。
  5. 麻醉小鼠（重复步骤7.1）并从商业引导套管中取出商业注射器。
    注意：在给予适当的时间长度以洗掉先前的注射后，可以重复注射不同的对照/代谢物。只要将套管固定在小鼠头上，就可以用不同的代谢物反复测试鼠标。

8. 显微注射系统的恢复

  1. 从微升注射器上拆卸聚乙烯管。
  2. 使用胰岛素注射器将空气注入管中，以丢弃聚乙烯管中的蒸馏水。清空微升注射器。
  3. 按配置屏幕上的重置位置以打开注射器停止定义屏幕（图4C）。
  4. 按 撤回 ，直到出现蜂鸣声，将显微注射泵重置为完全撤回的位置（图4C）。
  5. 如果此屏幕上有**已结束**符号，请返回命令屏幕并关闭显微注射控制器（图4C）。

9. 可选：通过神经示踪剂验证脑室内注射

  1. 以 7 nL/s 的递送速率注入 2，100 nL 的神经示踪剂以验证输注部位。
    注意：将注射器留在导向套管中5分钟以防止回流。
  2. 输注神经示踪剂后30分钟通过过量的异氟醚（5%）麻醉小鼠。
  3. 检查麻醉小鼠的呼吸频率和尾巴/爪子捏反射。
    注意：在下一步之前，鼠标必须无响应。
  4. 在肋骨下方的皮肤、肌肉和腹壁上做一个 4-5 厘米的切口。
  5. 小心地将肝脏稍微从横膈膜上移开。
  6. 切开隔膜以暴露小鼠的心脏。
  7. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）和PBS中冰冷的4%多聚甲醛灌注小鼠通过心脏。
  8. 将小鼠斩首，用显微解剖钳和显微解剖剪刀仔细解剖大脑，取出整个大脑23.将脑样品放入PBS中冰冷的4%多聚甲醛中3-4天，并用PBS洗涤3 x 5分钟。
  9. 在小鼠脑切片支架（1 mm /切片）的第八个切口（1 mm/切片）从前向到后方向将大脑切成两部分。将大脑放入包埋模具中，并将大脑样品嵌入低熔点琼脂糖（PBS中的4%）。
  10. 使用强力胶将嵌入琼脂糖中的大脑粘在振动切片机的舞台上。使用振动切片机将大脑冠状地切成50μm脑切片。
  11. 在室温下孵育在封闭缓冲液（1：1，000稀释度）中稀释的神经示踪剂的抗体中的脑切片过夜。
    注意：封闭缓冲液含有10%马血清，0.1%Triton X-100和0.02%叠氮化钠。
  12. 用PBST清洗切片3 x 5分钟（PBS含0.1%Triton X-100）。
  13. 在室温下将脑切片在封闭缓冲液（1：500稀释度）中稀释的荧光染料偶联二抗中孵育2小时。
  14. 用PBS清洗切片3 x 5分钟。
  15. 用含有4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂将脑切片安装在载玻片上。
  16. 用显微镜盖玻片盖住载玻片。
  17. 在滑动边缘涂上指甲油，以避免安装介质泄漏。
  18. 在室温下孵育过夜后，避光，使用荧光显微镜对输注部位的荧光信号进行成像。

10.可选：通过小鼠侧脑室中的定制不锈钢引导套管输注代谢物

  1. 遵循协议第 1-8 节，用不锈钢引导套管替换商业导引套管，通过鼠标中的不锈钢注射器注入化学品。
    注意：讨论部分详细介绍了不同商用和不锈钢插管的优缺点。
  2. 按照与方案第2节和第3节中所述相同的方式执行手术方案，但请记住用不锈钢导引套管替换商业导引套管（图5B）。
    注意：不锈钢导向套管、不锈钢假人和不锈钢喷油器（图 5A）是按照 材料表中显示的规格定制的。将定制的不锈钢导管插入孔中，直到达到所需的深度（2.0 mm）。
  3. 使用由显微注射控制器和显微注射泵组成的显微注射系统（图4B）（与协议第4-7节相同），通过不锈钢导管套管注入SCFA。对于不锈钢导向套管的不锈钢假人，轻轻弯曲不锈钢注射器的一侧，直到另一侧的尖端比不锈钢导向套管长 1 毫米。
  4. 通过不锈钢引导套管将2，100nL的神经示踪剂注入小鼠的侧脑室（与方案第9节相同）。
  5. 神经示踪剂输注后收集样本30分钟（与方案第9节相同）。
  6. 在神经示踪剂注入的脑切片中进行图像采集（与协议第9节相同）。

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Representative Results

在引导套管植入恢复后1周向小鼠注入SCFAs，以评估新型笼子中的运动活动。将小鼠放置在一个新的笼子中，并在前5分钟（输送速率为7nL / s）通过植入大脑侧脑室的商业引导套管向大脑注入2，100nL SCFAs或ACSF。输注后再记录30分钟新笼中的运动活动。在SCFAs和ACSF输注之间的新笼子中的运动活动没有观察到差异（图6）（每组n = 2只小鼠;数据显示为平均±s.e.m.并通过双向方差分析进行分析）。

为了验证引导套管在大脑区域植入的准确性，通过引导套管 以 与SCFAs相同的体积和递送速率（5分钟内2，100nL;7nL / s）将荧光神经示踪剂注入小鼠体内。30分钟后收集大脑进行组织学检查。在侧脑室和小鼠大脑周围区域检测到荧光染料（图7A）。在相同条件下，将不锈钢导引套管植入脑侧脑室，用于输注神经示踪剂。与引导套管类似，结果表明，即使在通过不锈钢引导套管输注后，在侧脑室和小鼠大脑周围区域也检测到荧光染料信号（图7B）。

Figure 1
图1：自由移动小鼠脑室输注的程序。 自由移动的小鼠中肠道来源的微生物代谢物的脑室内递送流程图。缩写：SCFAs = 短链脂肪酸。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图2：在小鼠中植入商业导引套管 。 （A）商业导引套管、假人和注射器的代表性图像。（B）用牙丙烯固定植入小鼠大脑的商业导引套管和假人的代表性图像。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
图 3：用于行为测试的脑室输液装置。 显微注射系统、视频记录系统和行为装置的示意图。缩写：SCFAs = 短链脂肪酸。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图 4： 显微注射系统。 （A）使用显微注射泵安装微升注射器。（B）将连接聚乙烯管的商用注射器插入商业导向套管（C）显微注射控制器的触摸屏。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 5
图5：在小鼠侧脑室植入不锈钢导管 。 （A）不锈钢导引套管、假人和注射器的代表图像。（B）用牙亚克力固定植入小鼠大脑的不锈钢导引套管和假人的代表图像。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 6
图6：SCFAs注入小鼠在新型笼中的运动活性 。 （A）ACSF或SCFAs输注时引导套管植入和新型笼式运动的时间线示意图。（B）输液注射器放置的时间线示意图，输液窗口（蓝色阴影）和新型笼子行为测试。（C）ACSF和SCFAs注入小鼠在新笼中移动的总距离35分钟。输注的时间窗口用蓝色阴影（0-5分钟）表示。（D）在新型笼子中ACSF和SCFAs注入小鼠的轨迹的代表性图像。n = 每组2只小鼠。数据显示为平均± s.e.m.，并通过双向方差分析进行分析。NS：不重要。缩写：SCFAs = 短链脂肪酸;ACSF = 人工脑脊液。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 7
图7：脑注入荧光染料的组织学。 通过植入小鼠侧脑室（LV）的定制（A）商业和（B）不锈钢引导套管输注。比例尺 = 1 毫米（左）和 500 微米（右）。蓝色：DAPI 染色;绿色：抗荧光金标签。缩写：LV = 侧心室;AC = 前连合;CPu = 尾状壳核;LS = 侧隔;MS = 内侧隔膜。 请点击此处查看此图的大图。

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Discussion

肠道来源的代谢物与脑介导的疾病有关，没有太多精确的机制，部分原因是它们在体内的多个结合位点6，12，24。先前的报告表明，SCFAs可以作为G蛋白偶联受体的配体，表观遗传调节因子和体内多个部位的能量产生来源6，12。为了绕过源自外周的混杂因素（如免疫细胞、激素和自主神经系统），在自由移动的小鼠中，通过引导套管将脑室内SCFAs注射到大脑中，开发了一种方法。此外，对插管和输注部位进行了验证，以探索可能受SCFA影响的大脑区域。总之，本文提出了一种精确、细致且经过验证的方法，将肠道衍生代谢物输送到大脑中，用于肠脑轴研究。

通过引导套管将药物和化学物质输送到动物体内的脑室内已经得到完善 25，26，27，28，29 用于各种药物测试29，疾病建模26，28和行为测试的具体设计27.最重要的是，一些研究已经通过脑室内注射将肠道微生物代谢物输送到大脑中，并测试了它们对生理功能的影响30，31，32，33。该协议提供了一个附加属性，可以实时以急性方式向大脑施用肠道代谢物，这将使科学家能够理解肠道代谢物对大脑和行为的动态影响。

代谢物输注的输送速率对于模拟脑室中脑脊液的流动至关重要。一项研究表明，小鼠的脑脊液产生率为5.3 nL / s34。为了控制自由移动小鼠中自然SCFAs的流速，我们评估了该显微注射系统的流速（图3和图4）。即使使用350厘米长的聚乙烯管将SCFA注入自由移动的鼠标中，SCFA也可以顺利注入而没有太大阻力。通过填充蒸馏水和矿物油以降低聚乙烯管中的液体阻力（参见协议第5节和第6节），流速可以从100 nL/s降低到7 nL/s。以7nL / s的流速注入SCFAs或ACSF不会导致小鼠的任何异常行为。

用于脑室内注射的肠道来源代谢物的量和剂量至关重要。全面分析不同大脑区域中肠道衍生代谢物的绝对水平仍然具有挑战性。例如，很少有研究表明可以检测大脑中SCFA的生理水平35，36。一项研究表明，小鼠大脑中乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐的浓度分别为约1640.6-3281.2μg/g、288.18-384.24μg/g和44.036-66.054μg/g，分别为36。然而，另一项研究报告了大脑中SCFAs水平较低（醋酸盐128.1微克/克，丙酸盐0.3883微克/克，丁酸盐0.1640微克/克）35。该方案中采用的醋酸盐、丙酸盐和丁酸盐的输注量分别为 5.81385 μg/g、4.62378 μg/g 和 2.6124 μg/g。因此，该方案中注入的SCFA的浓度与生理浓度相当。然而，我们不能排除SCFAs浓度在不同大脑区域可能有所不同的可能性。几项研究表明，通过脑室内注射将丙酸盐输送到脑室（1分钟内4μL0.26M丙酸;约249.756μg/ g）损害了大鼠的社会行为和认知30，31。注入丙酸盐的剂量和流速相对较高，如小鼠35 和大鼠37所报道的那样。因此，大脑和外围代谢物分析和代谢组学分析的进展将有助于研究人员更好地了解肠道衍生代谢物的空间和时间动态变化。

该协议中提出了两种类型的引导插管，用于小鼠脑室内注射 - 商业引导套管和不锈钢引导套管。商业指南套管和假人专为植入而设计。由于盖子的原因，鼠标不容易取出定制的假人。相反，在1周的恢复过程中，小鼠可以很容易地将不锈钢假人从不锈钢引导套管中取出，导致套管中的血液/脑脊液凝固。然而，商业定制的套管是64毫克，这个套管的假人是86毫克。因此，商业定制的套管和假人的总重量为150毫克。相比之下，定制的不锈钢导向套管为18.3毫克，该套管的假人为8.5毫克。因此，定制的不锈钢导向套管的总重量为26.8毫克。从理论上讲，不锈钢导向套管组的重量轻，可以最大限度地减少套管对动物运动和大脑的影响。而且，商用导引套管的成本高于不锈钢导引套管和喷油器。因此，我们建议对没有经验的研究人员在小鼠中进行立体定位手术使用不锈钢导引套管。

由于脑损伤，植入的套管可能会被血液和脑脊液堵塞。这种套管堵塞可能更频繁地发生在商业套管上方的不锈钢套管中。假人可以螺纹拧紧商业套管（图2A），但不能拧紧不锈钢套管（图5A）。因此，确保在恢复期间连接假人将最大限度地减少套管的堵塞。如果在 1 周恢复期间发生分离，则必须插入新的假人。此外，在安装连接聚乙烯管的注射器之前，必须多次插入一次性灭菌注射器以疏通套管。

麻醉药物的选择将极大地影响手术和行为测试。在这里，吸入麻醉剂异氟醚被选择而不是注射麻醉剂，因为恢复时间更短，并且出于人道原因对动物的危害较小。然而，异氟醚吸入的剂量可以根据小鼠的状态和体重而变化。因此，在整个手术过程中必须密切观察麻醉状态，并相应地调整异氟醚蒸发器。 在所有 手术过程中，优化的呼吸频率应为每秒一次呼吸。此外，装满活性炭的气体过滤罐应与麻醉室和鼻锥面罩相连，以消除操作区域内的异氟醚和废气污染。这将保护外科医生免受异氟醚的毒性作用。

代表性结果表明，SCFAs输注对新型笼子中的运动没有产生任何显着影响。这可能是因为使用了少量动物来获得此结果（图6）。此外，我们仅在新型笼式运动行为测试的前5分钟内注入SCFA，而不是整个测试，因为大多数行为是在短时间内（5-15分钟）测试的。肠道来源的微生物代谢物的时间窗口应根据研究人员的假设进行调整。

麻醉时间和从麻醉中恢复意识对于行为测试至关重要。在这里，对小鼠进行短暂麻醉以进行注射器植入和SCFAs输注，并在15分钟后进行行为测试。停止吸入麻醉后的恢复时间是根据先前的研究38确定的。一项初步研究确保小鼠在麻醉后15分钟保持活跃，自由移动，并且不会感到不舒服。我们介绍了安装注射器的麻醉步骤，原因如下。首先，喷油器量规为33 G;当动物积极移动时，将如此精致的注射器插入套管是非常具有挑战性的。此外，意识小鼠的蹂躏可能会对小鼠39产生压力，混淆行为结果。其次，由于血液/脑脊液的凝固，套管偶尔会堵塞。在安装注射器之前轻轻疏通套管将是代谢物输注的理想选择。基于这两个原因，建议对小鼠进行短暂麻醉以安装注射器。如果担心动物从吸入麻醉中恢复，研究人员可以等待更长的时间（30 分钟）。此外，可以设置一组单独的输液注射器连接聚乙烯管以加速实验。

此协议有几个限制。首先，引导套管和连接聚乙烯管的植入将限制将用于光遗传学和光纤光度测量的光纤植入同一坐标、周围区域甚至大脑同一半球的手术区域。将用于显微内窥镜检查的晶状体与植入的引导套管一起植入小鼠头上将更具挑战性。其次，引导套管的植入可能会在小鼠头上产生显着的重量。定制插管组的总重量为26.8-150毫克，螺钉为~48毫克，安装的牙科丙烯酸为450-500毫克。整个安装集可能会限制鼠标的移动。然而，最近的研究已经植入了一个微型镜，用于监测自由移动小鼠的钙信号40，41。微型镜的重量范围为1.6克至4.5克，不包括螺钉和牙科丙烯酸。因此，对于小鼠行为测试，引导套管的重量可以被认为是相对可接受的。第三，用于输液的连接聚乙烯管长~350厘米，这可能会限制小鼠在行为测试期间的运动。为了解决这个问题，可能需要在露天测试中对运动进行预测试，以评估连接聚乙烯管对小鼠电机功能的影响。第四，牙科丙烯酸可能对小鼠产生神经毒性作用。但是，在测试期间需要将引导套管连接到鼠标头上。为了减少牙科丙烯酸对小鼠的潜在神经毒性作用，操作人员必须熟悉牙科丙烯酸树脂的使用。当牙科丙烯酸混合物（粉末和液体）略微凝固以减少牙科丙烯酸液体渗透到大脑中时，牙科丙烯酸酯会更好地应用。

微生物群及其代谢物与不同发育里程碑的行为功能有关。尽管该协议基于体重范围为26g至30g的成年C57BL / 6小鼠，但它也可以应用于不同年龄和大小的小鼠。以前的研究已经在年轻小鼠42，43，44，45中采用了立体定位手术。然而，大脑区域的坐标可能会根据小鼠的大小和年龄而变化。我们建议参考与年龄对应的地图集或在线资源（http://mouse.brain-map.org/static/atlas）。此外，必须通过将台盼蓝或荧光染料注入年轻的剔除小鼠中来验证坐标，从而在对实验小鼠执行之前优化方法。该协议中使用的引导插管都是定制的，可以在验证不同大小的小鼠的坐标后进行调整。

该协议将与大多数啮齿动物行为测试兼容，在设备顶部有一个开放的竞技场，无需太多修改。啮齿动物行为测试可以用聚乙烯管在鼠标头顶部进行，没有任何障碍，包括露天测试，高架加/零迷宫，降压测试，直接社交互动，成人超声波发声，强制游泳测试，尾部悬挂，水迷宫，T或Y迷宫，新颖物体识别，大理石掩埋，自我修饰测试，横梁交叉， 极点测试，和避水应力暴露。使用封闭室或管的测试需要修改，以允许聚乙烯管与小鼠一起自由移动，例如三室社会测试，明暗盒，恐惧条件反射，蔗糖偏好，约束应激，惊吓测试和脉冲前脉冲抑制。我们建议在测试前预先测试并估计剔除小鼠上聚乙烯管所需的长度。

肠道微生物代谢物已被证明会影响宿主行为8，46，47，48，49。科学家可以采用这种方法直接研究肠道微生物群衍生代谢物对大脑和小鼠行为的时间和空间影响。例如，微生物代谢物4-乙基苯基硫酸盐（4EPS）在ASD的临床前小鼠模型和ASD46，48，49患者中增加。注射 4EPS 和产生 4EPS 的细菌定植增加了焦虑样行为，并损害了小鼠丘脑室旁核 （PVT） 中的少突胶质细胞成熟46，48。在焦虑样行为测试中评估4EPS对小鼠PVT的直接影响将是很有趣的。然而，PVT中4EPS的绝对浓度仍然未知。因此，剂量反应测试对于确定 PVT 中 4EPS 的充分水平可能至关重要。对于其他微生物代谢物对大脑和行为的影响，可以采用类似的概念。

基于电路的神经技术，如光遗传学、化学遗传学和体内钙成像，是使科学家能够理解神经回路控制行为的关键方法50，51，52。肠脑轴是一个复杂的连接，对肠道微生物及其代谢物介导宿主行为至关重要。越来越多的研究采用基于电路的神经技术来理解肠道和大脑之间有趣的串扰33，53，54，55，56，57，58，59。该协议将提供一种替代方法来理解由肠道代谢物引起的基于大脑区域的行为控制。将该协议与基于电路的神经技术相结合将使研究人员能够深入了解肠道代谢物对行为和大脑活动的基于电路的控制。

总之，肠脑轴的概念在科学界被广泛接受，并促进了肠道衍生代谢物参与神经精神疾病的可能性11，13，60，61，62，63，64，65.为了探究肠道衍生代谢物如何以及哪些影响小鼠的大脑和行为，该领域将需要一种全面的、基于生理学的方法。本文提供了一个分步方案，将肠道衍生的代谢物直接输送到大脑中，最重要的是，在自由移动的小鼠中。这种设计可以进一步适应，通过将肠道衍生的代谢物输送到不同的大脑区域来研究区域特异性影响。

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Disclosures

作者与本作品没有利益冲突。

Acknowledgments

我们感谢国立成功大学（NCKU）实验动物中心的工作人员照顾动物。这项工作得到了正兴医学基金会黄坤彦教授教育基金的奖学金支持;台湾科技部（MOST）的资助：（本科生研究MOST 109-2813-C-006-095-B）到T.-H.Y.;（大多数 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3） 至 W.-L.W.;以及高等教育萌芽项目，教育部到NCKU大学发展总部到W.-L.W。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 Pfizer n/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit ThermoFisher Scientific A-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal) Millipore AB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile NEST 121921LA01
CaCl2  Sigma-Aldrich C1016 ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2% Phoenix NDC 57319-611-09
Chlorhexidine solution Phoenix NDC 57319-599-09
Commercial dummy RWD Life Science 62004 Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannul RWD Life Science 62104 Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injector RWD Life Science 62204 Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylic HYGENIC n/a
Fixing screws RWD Life Science 62521
Fluoroshield mounting medium with DAPI Abcam AB104139
Horse serum ThermoFisher Scientific 16050130
Insulin syringes BBraun XG-LBB-9151133S-1BX 1 mL
Isoflurane  Panion & BF biotech DG-4900-250D
KCl  Sigma-Aldrich P3911 ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen  Swiss Pharmaceutical n/a
Lidocaine  AstraZeneca n/a
Low melting point agarose Invitrogen 16520
MgCl2  Sigma-Aldrich M8266 ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slips MARIENFELD 101242
Microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NF Macron Fine Chemicals MA-6358-04
NaCl  Sigma-Aldrich S9888 ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S8282 ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3  Sigma-Aldrich S5761 ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue) 3M 1469SB 3M Vetbond
Neural tracer  Santa Cruz SC-358883 FluoroGold
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Polyethylene tube RWD Life Science 62329 OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) Ointment Dechra  12920060
Sodium acetate  Sigma-Aldrich S2889 SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide  Sigma-Aldrich S2002
Sodium butyrate  Sigma-Aldrich B5887 SCFAs: 8 mM
Sodium propionate  Sigma-Aldrich P1880 SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannula Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injector Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
Superglue Krazy Glue KG94548R
Triton X-100 Merck 1.08603.1000
Equipment
Cannula holder RWD Life Science B485-68217
Ceiling camera FOSCAM R2
Digital stereotaxic instruments Stoelting 51730D
Dissecting microscope INNOVIEW SEM-HT/TW
Glass Bead Sterilizer RWD Life Science RS1501
Heating pad Stoelting 53800M
Leica microscope  Leica DM2500
Micro Dissecting Forceps ROBOZ RS-5136 Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting Scissors ROBOZ RS-5918 4.5" Angled Sharp
Microinjection controller World Precision Instruments (WPI) MICRO2T SMARTouch Controller
Microinjection syringe pump World Precision Instruments (WPI) UMP3T-1 UltraMicroPump3  
Microliter syringe Hamilton 80014 10 µL
Optical Fiber Cold Light with double Fiber Step LGY-150 Local vendor
Pet trimmer WAHL 09962-2018
Vaporiser for Isoflurane Step AS-01 Local vendor
Vibratome Leica VT1000S
Software
Animal behavior video tracking software Noldus EthoVision Version: 15.0.1416
Leica Application Suite X software Leica LASX Version: 3.7.2.22383

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神经科学，第184期，
自由移动小鼠中肠道来源的微生物代谢物的脑室内递送
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Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L. Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (184), e63972, doi:10.3791/63972 (2022).

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