교란되지 않고 손상된 마우스 골격근에서 섬유 지방 형성 전구 세포 및 근육 줄기 세포의 FACS 분리 및 배양
Summary
섬유-지방형성 전구세포(FAP)와 근육 줄기세포(MuSC)의 정확한 식별은 생리학적 및 병리학적 조건에서 생물학적 기능을 연구하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 성인 마우스 근육에서 FAP 및 MuSC의 분리, 정제 및 배양에 대한 지침을 제공합니다.
Abstract
섬유-지방형성 전구 세포(FAP)는 섬유원성, 지방형성성, 골인성 또는 연골성 계통을 따라 분화할 수 있는 골격근에 거주하는 중간엽 기질 세포(MSC)의 집단입니다. 근육 줄기 세포(MuSC)와 함께 FAP는 근육 항상성, 복구 및 재생에 중요한 역할을 하는 동시에 세포외 기질(ECM)을 적극적으로 유지 및 리모델링합니다. 만성 손상 및 근이영양증과 같은 병리학적 상태에서, FAP는 비정상적인 활성화를 거쳐 콜라겐-생성 섬유아세포 및 지방세포로 분화하여, 섬유증 및 근육내 지방 침윤을 유도한다. 따라서, FAP는 MuSC 회전율을 유지하고 조직 복구를 촉진하거나 골격근 조직의 완전성 및 기능을 손상시키는 섬유성 흉터 형성 및 이소성 지방 침윤에 기여함으로써 근육 재생에서 이중 역할을 한다. FAP 및 MuSC의 적절한 정제는 병리학적 조건뿐만 아니라 생리학적 조건에서 이들 세포의 생물학적 역할을 이해하기 위한 전제 조건이다. 여기에서는 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 성인 마우스의 사지 근육으로부터 FAP 및 MuSC를 동시에 분리하기위한 표준화 된 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 전체 사지 근육 및 손상된 경골 전방 (TA) 근육에서 단핵 세포의 기계적 및 효소 적 해리를 자세히 설명합니다. FAP 및 MuSC는 순수 세포 집단을 얻기 위해 반자동 세포 분류기를 사용하여 연속적으로 분리됩니다. 또한 대기 및 활성화된 FAP 및 MuSC를 단독으로 또는 공동 배양 조건에서 배양하기 위한 최적화된 방법을 설명합니다.
Introduction
골격근은 성인 체중의 ~40%를 차지하는 신체에서 가장 큰 조직으로 자세 유지, 움직임 생성, 기초 에너지 대사 조절 및 체온1을 담당합니다. 골격근은 매우 역동적인 조직이며 기계적 스트레스, 대사 변화 및 일상적인 환경 요인과 같은 다양한 자극에 적응하는 놀라운 능력을 가지고 있습니다. 또한 골격근은 급성 손상에 반응하여 재생되어 형태와 기능을 완전히 회복시킵니다2. 골격근 가소성은 주로 근섬유 원형질막과 기저층 2,3 사이에 위치한 위성 세포라고도 하는 상주 근육 줄기 세포(MuSC) 집단에 의존합니다. 정상적인 조건에서 MuSC는 정지 상태로 근육 틈새에 상주하며 세포 회전율을 보상하고 줄기 세포 풀을 보충하기 위해 몇 개의 분할 만 있습니다4. 부상에 대한 반응으로 MuSC는 세포주기에 들어가 증식하며 새로운 근육 섬유의 형성에 기여하거나자가 재생 과정에서 틈새로 돌아갑니다 2,3. MuSC 외에도 골격근의 항상성 유지 및 재생은 섬유-지방형성 전구세포(FAP)5,6,7라고 하는 근육 상주 세포 집단의 지원에 의존합니다. FAP는 근육 결합 조직에 내재된 중간엽 기질 세포이며 섬유원성, 지방원성, 골인성 또는 연골성 계통 5,8,9,10을 따라 분화할 수 있습니다. FAP는 근육 줄기 세포 틈새에서 세포 외 기질 단백질의 공급원이기 때문에 MuSC에 대한 구조적 지원을 제공합니다. FAP는 또한 근형성 및 근육 성장에 대한 영양 지원을 제공하는 사이토카인및 성장 인자를 분비하여 골격근의 장기 유지를 촉진합니다6,11. 급성 근육 손상시, FAP는 빠르게 증식하여 재생 근육의 구조적 완전성을 지지하고 파라크린 방식으로 MuSCs 증식 및 분화를 유지하기 위한 유리한 환경을 제공하는 일시적인 틈새를 생성한다5. 재생이 진행됨에 따라 FAP는 세포 사멸에 의해 재생 근육에서 제거되고 그 수는 점차 기초 수준12로 돌아갑니다. 그러나, 만성 근육 손상을 선호하는 조건에서, FAP는 프로 세포 사멸 신호 전달을 무시하고 근육 틈새에 축적되어 콜라겐 생성 섬유 아세포 및 지방 세포로 분화하여 이소성 지방 침윤 및 섬유 성 흉터 형성을 유도한다12,13.
다분화능과 재생 능력으로 인해 FAP와 MuSC는 골격근 장애 치료를 위한 재생 의학의 잠재적 표적으로 확인되었습니다. 따라서, 이들의 기능 및 치료 잠재력을 조사하기 위해서는 FAP 및 MuSC의 분리 및 배양을 위한 효율적이고 재현 가능한 프로토콜을 수립하는 것이 중요하다.
형광 활성화 세포 분류(FACS)는 크기 및 입도와 같은 형태학적 특성을 기반으로 다양한 세포 집단을 식별할 수 있으며 세포 표면 마커에 대한 항체의 사용을 기반으로 세포 특이적 분리를 허용합니다. 성체 마우스에서 MuSC는 혈관 세포 접착 분자 1 (VCAM-1, CD106이라고도 함) 14,15 및 α7- 인테그린 15를 발현하는 반면, FAP는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 α (PDGFRα) 및 줄기 세포 항원 1 (Sca1 또는 Ly6A / E) 5,6,9,12,16,17 . 여기에 설명된 프로토콜에서 MuSC는 CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-인테그린+로 식별된 반면, FAP는 CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-인테그린-으로 식별되었습니다. 대안적으로, PDGFRαEGFP 마우스를 사용하여 FAP를 CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-인테그린-이벤트18,19로 단리하였다. 또한 PDGFRα-GFP+ 세포의 형광 신호 간의 중첩을 표면 마커 Sca1로 식별된 세포와 비교했습니다. 우리의 분석은 모든 GFP-발현 세포가 Sca1에 대해서도 양성임을 보여주었으며, 이는 FAP의 식별 및 분리를 위해 두 접근법 중 하나를 사용할 수 있음을 나타냅니다. 마지막으로, 특이적 마커 항체로 염색하여 각 세포군의 순도를 확인하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
순수 성체 줄기 세포 집단의 식별 및 분리를 위한 효율적이고 재현 가능한 프로토콜을 수립하는 것은 그 기능을 이해하기 위한 첫 번째이자 가장 중요한 단계입니다. 분리된 FAP 및 MuSC는 근육 질환에 대한 잠재적인 치료법으로서 이식 실험에서 다중오믹스 분석을 수행하는 데 사용될 수 있거나 줄기 세포 치료에서 질병 모델링을 위해 유전적으로 변형될 수 있다.
여기에 설명…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MuSC 격리에 대한 조언을 해주신 Tom Cheung (Hong Kong University of Science & Technology)에게 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 AR041126 및 AR041164를 통해 NIAMS-IRP에서 자금을 지원했습니다.
Materials
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
Riferimenti
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