Summary

FACS-isolement et culture de progéniteurs fibro-adipogènes et de cellules souches musculaires à partir de muscles squelettiques de souris non perturbés et blessés

Published: June 08, 2022
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Summary

L’identification précise des cellules progénitrices fibro-adipogènes (PAF) et des cellules souches musculaires (MuSC) est essentielle pour étudier leur fonction biologique dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ce protocole fournit des lignes directrices pour l’isolement, la purification et la culture des PAF et des MuSC à partir de muscles de souris adultes.

Abstract

Les cellules progénitrices fibro-adipogènes (FAP) sont une population de cellules stromales mésenchymateuses (CSM) résidentes du muscle squelettique capables de se différencier selon une lignée fibrogénique, adipogénique, ostéogénique ou chondromogène. Avec les cellules souches musculaires (MuSC), les FAP jouent un rôle essentiel dans l’homéostasie, la réparation et la régénération musculaires, tout en maintenant et en remodelant activement la matrice extracellulaire (ECM). Dans des conditions pathologiques, telles que les dommages chroniques et les dystrophies musculaires, les FAP subissent une activation aberrante et se différencient en fibroblastes et adipocytes producteurs de collagène, entraînant une fibrose et une infiltration graisseuse intramusculaire. Ainsi, les FAP jouent un double rôle dans la régénération musculaire, soit en maintenant le renouvellement du MuSC et en favorisant la réparation des tissus, soit en contribuant à la formation de cicatrices fibrotiques et d’infiltrats de graisse ectopique, qui compromettent l’intégrité et la fonction du tissu musculaire squelettique. Une purification adéquate des FAP et des MuSC est une condition préalable à la compréhension du rôle biologique de ces cellules dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ici, nous décrivons une méthode standardisée pour l’isolement simultané des FAP et des MuSC des muscles des membres de souris adultes en utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Le protocole décrit en détail la dissociation mécanique et enzymatique des cellules mononucléées des muscles entiers des membres et des muscles tibiaux antérieurs (TA) blessés. Les FAP et les MuSC sont ensuite isolés à l’aide d’un trieur de cellules semi-automatisé pour obtenir des populations de cellules pures. Nous décrivons en outre une méthode optimisée pour la culture de FAP et de MuSC quiescents et activés, seuls ou dans des conditions de coculture.

Introduction

Le muscle squelettique est le plus grand tissu du corps, représentant ~ 40% du poids humain adulte, et est responsable du maintien de la posture, de la génération de mouvement, de la régulation du métabolisme énergétique de base et de la température corporelle1. Le muscle squelettique est un tissu très dynamique et possède une capacité remarquable à s’adapter à une variété de stimuli, tels que le stress mécanique, les altérations métaboliques et les facteurs environnementaux quotidiens. En outre, le muscle squelettique se régénère en réponse à une blessure aiguë, conduisant à une restauration complète de sa morphologie et de ses fonctions2. La plasticité des muscles squelettiques repose principalement sur une population de cellules souches musculaires résidentes (MuSC), également appelées cellules satellites, situées entre la membrane plasmique myofibreuse et la lame basale 2,3. Dans des conditions normales, les MuSCs résident dans la niche musculaire dans un état de repos, avec seulement quelques divisions pour compenser le renouvellement cellulaire et reconstituer le pool de cellules souches4. En réponse à une blessure, les MuSCs entrent dans le cycle cellulaire, prolifèrent et contribuent à la formation de nouvelles fibres musculaires ou retournent dans la niche dans un processus d’auto-renouvellement 2,3. En plus des MuSC, le maintien homéostatique et la régénération du muscle squelettique reposent sur le soutien d’une population de cellules résidentes musculaires appelées progéniteurs fibro-adipogènes (PAF)5,6,7. Les FAP sont des cellules stromales mésenchymateuses intégrées dans le tissu conjonctif musculaire et capables de se différencier le long de la lignée fibrogénique, adipogénique, ostéogène ou chondrogène 5,8,9,10. Les FAP fournissent un soutien structurel aux MuSC car ils sont une source de protéines de la matrice extracellulaire dans la niche des cellules souches musculaires. Les PAF favorisent également le maintien à long terme du muscle squelettique en sécrétant des cytokines et des facteurs de croissance qui fournissent un soutien trophique à la myogenèse et à la croissance musculaire 6,11. Lors d’une lésion musculaire aiguë, les FAP prolifèrent rapidement pour produire une niche transitoire qui soutient l’intégrité structurelle du muscle régénérant et fournit un environnement favorable pour soutenir la prolifération et la différenciation des MuSC de manière paracrine5. Au fur et à mesure que la régénération progresse, les FAP sont éliminés du muscle régénératif par apoptose, et leur nombre revient progressivement au niveau basal12. Cependant, dans des conditions favorisant les lésions musculaires chroniques, les FAP remplacent la signalisation pro-apoptotique et s’accumulent dans la niche musculaire, où ils se différencient en fibroblastes et adipocytes producteurs de collagène, entraînant des infiltrats de graisse ectopique et la formation de cicatrices fibrotiques12,13.

En raison de leur multipotence et de leurs capacités de régénération, les FAP et les MuSC ont été identifiés comme des cibles potentielles en médecine régénérative pour le traitement des troubles des muscles squelettiques. Par conséquent, pour étudier leur fonction et leur potentiel thérapeutique, il est important d’établir des protocoles efficaces et reproductibles pour l’isolement et la culture des FAP et des MuSC.

Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) permet d’identifier différentes populations cellulaires en fonction de caractéristiques morphologiques telles que la taille et la granularité, et permet une isolation spécifique à la cellule basée sur l’utilisation d’anticorps dirigés contre les marqueurs de surface cellulaire. Chez les souris adultes, les MuSC expriment la molécule d’adhésion cellulaire vasculaire 1 (VCAM-1, également connue sous le nom de CD106)14,15 et α7-Integrin 15, tandis que les FAP expriment le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes α (PDGFRα) et l’antigène des cellules souches 1 (Sca1 ou Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . Dans le protocole décrit ici, les MuSC ont été identifiés comme CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, tandis que les FAP ont été identifiés comme CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Alternativement, des souris PDGFRαEGFP ont été utilisées pour isoler les FAP en tant qu’événements CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-18,19. De plus, nous avons comparé le chevauchement entre le signal fluorescent des cellules PDGFRα-GFP+ et les cellules identifiées par le marqueur de surface Sca1. Notre analyse a montré que toutes les cellules exprimant la GFP étaient également positives pour Sca1, ce qui indique que l’une ou l’autre approche peut être utilisée pour l’identification et l’isolement des FAP. Enfin, la coloration avec des anticorps marqueurs spécifiques a confirmé la pureté de chaque population cellulaire.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux effectuées ont été menées conformément aux directives institutionnelles approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux (ACUC) de l’Institut national de l’arthrite, des maladies musculo-squelettiques et cutanées (NIAMS). Les enquêteurs qui exécutent ce protocole doivent respecter leurs lignes directrices locales en matière d’éthique animale. REMARQUE: Ce protocole décrit en détail comment isoler les FAP et les MuSC des…

Representative Results

Ce protocole permet d’isoler environ un million de PAF et jusqu’à 350 000 MuSC à partir de membres postérieurs non blessés de souris adultes de type sauvage (3 à 6 mois), ce qui correspond à un rendement de 8 % pour les PAF et de 3 % pour les MuSC d’événements totaux. Lors du tri des cellules de TA endommagées 7 jours après la blessure, deux à trois muscles TA sont mis en commun pour obtenir jusqu’à 300 000 FAP et 120 000 MuSC, ce qui correspond à un rendement de 11% et 4%, respectivement. Les valeur…

Discussion

L’établissement de protocoles efficaces et reproductibles pour l’identification et l’isolement des populations de cellules souches adultes pures est la première et la plus importante étape pour comprendre leur fonction. Les FAP et les MuSC isolés peuvent être utilisés pour effectuer des analyses multiomiques dans des expériences de transplantation en tant que traitement potentiel des maladies musculaires ou peuvent être génétiquement modifiés pour la modélisation de la maladie dans la thérapie par cell…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Tom Cheung (Université des sciences et technologies de Hong Kong) pour ses conseils sur l’isolement du MusC. Ce travail a été financé par le NIAMS-IRP grâce aux subventions AR041126 et AR041164 des NIH.

Materials

5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Falcon 352063
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap Falcon 352235
20 G BD Needle 1 in. single use, sterile BD Biosciences  305175
anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) The University of British Columbia 53-0010-01
APC anti-mouse CD31 Antibody BioLegend 102510
APC anti-mouse CD45 Antibody BioLegend 103112
BD FACSMelody Cell Sorter BD Biosciences 
BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL BD Biosciences  309604
Biotin anti-mouse CD106 Antibody BioLegend 105703
C57BL/6J  mouse (Female and Male) The Jackson Laboratory 000664
B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse The Jackson Laboratory 007669
Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate Corning 356400
Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate Corning 356500
Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate Corning 356408
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher Scientific 62248
Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile VWR 414004-265
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11055
Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile Corning 352340
Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile Corning 353002
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL VWR 352196
Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL Corning 352070
Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning VWR 60819-728
Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning VWR 21008-948
Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) Promega G5071
FlowJo 10.8.1
Gibco Collagenase, Type II, powder ThermoFisher Scientific 17101015
Gibco Dispase, powder ThermoFisher Scientific 17105041
Gibco DMEM, high glucose, HEPES ThermoFisher Scientific 12430054
Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States ThermoFisher Scientific 16000044
Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix ThermoFisher Scientific 11550043
Gibco Horse Serum, New Zealand origin ThermoFisher Scientific 16050122
Gibco PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010023
Gibco PBS (10x), pH 7.4 ThermoFisher Scientific 70011044
Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) ThermoFisher Scientific 10378016
Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 ThermoFisher Scientific A-21127
Hardened Fine Scissors Fine Science Tools Inc 14090-09
Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) ThermoFisher Scientific A1310
Mouse PDGF R alpha Antibody R&D Systems AF1062
Normal Donkey Serum Fisher Scientific NC9624464
Normal Goat Serum ThermoFisher Scientific 31872
Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody BioLegend 108120
Paraformaldehyde, 16% Fisher Scientific NCC0528893
Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) Developmental Study Hybridoma Bank N/A
PE/Cyanine7 Streptavidin BioLegend 405206
Student Vannas Spring Scissors Fine Science Tools Inc 91500-09
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools Inc 91150-20
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Riparini, G., Simone, J. M., Sartorelli, V. FACS-Isolation and Culture of Fibro-Adipogenic Progenitors and Muscle Stem Cells from Unperturbed and Injured Mouse Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (184), e63983, doi:10.3791/63983 (2022).

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