FACS-изоляция и культура фибро-адипогенных предшественников и мышечных стволовых клеток из невозмутимых и поврежденных скелетных мышц мыши
Summary
Точная идентификация фибро-адипогенных клеток-предшественников (FAPs) и мышечных стволовых клеток (MuSC) имеет решающее значение для изучения их биологической функции в физиологических и патологических состояниях. Этот протокол содержит рекомендации по выделению, очистке и культивированию ФАПов и MUSC из мышц взрослых мышей.
Abstract
Фибро-адипогенные клетки-предшественники (ФАП) представляют собой популяцию скелетных мышечных мезенхимальных стромальных клеток (МСК), способных дифференцироваться по фиброгенной, адипогенной, остеогенной или хондрогенной линии. Вместе с мышечными стволовыми клетками (MuSC) FAP играют решающую роль в гомеостазе мышц, восстановлении и регенерации, активно поддерживая и реконструируя внеклеточный матрикс (ECM). При патологических состояниях, таких как хронические повреждения и мышечные дистрофии, ФАП подвергаются аберрантной активации и дифференцируются в коллаген-продуцирующие фибробласты и адипоциты, что приводит к фиброзу и внутримышечной жировой инфильтрации. Таким образом, ФАП играют двойную роль в регенерации мышц, либо поддерживая оборот MuSC и способствуя восстановлению тканей, либо способствуя образованию фиброзных рубцов и внематочных жировых инфильтратов, которые ставят под угрозу целостность и функцию скелетной мышечной ткани. Правильная очистка ФАПов и MuSC является необходимым условием для понимания биологической роли этих клеток как в физиологических, так и в патологических состояниях. Здесь мы описываем стандартизированный метод одновременного выделения FAP и MuSC из мышц конечностей взрослых мышей с использованием флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Протокол подробно описывает механическую и ферментативную диссоциацию мононуклеарных клеток из целых мышц конечностей и травмированных передних (ТА) мышц большеберцовой кости. FAP и MuSC впоследствии изолируются с помощью полуавтоматического клеточного сортировщика для получения чистых клеточных популяций. Дополнительно описан оптимизированный метод культивирования покоящихся и активированных ФАПов и MUSC, либо отдельно, либо в условиях кокультуры.
Introduction
Скелетная мышца является самой большой тканью в организме, на которую приходится ~ 40% веса взрослого человека, и отвечает за поддержание осанки, создание движения, регулирование базального энергетического обмена и температуры тела1. Скелетные мышцы являются очень динамичной тканью и обладают замечательной способностью адаптироваться к различным раздражителям, таким как механическое напряжение, метаболические изменения и ежедневные факторы окружающей среды. Кроме того, скелетная мышца регенерирует в ответ на острую травму, что приводит к полному восстановлению ее морфологии и функций2. Пластичность скелетных мышц в основном зависит от популяции резидентных мышечных стволовых клеток (MuSC), также называемых сателлитными клетками, которые расположены между плазматической мембраной миофибры и базальной пластинкой 2,3. В нормальных условиях MuSC находятся в мышечной нише в состоянии покоя, с несколькими делениями, чтобы компенсировать клеточный оборот и пополнить пул стволовых клеток4. В ответ на травму MuSC входят в клеточный цикл, размножаются и либо способствуют образованию новых мышечных волокон, либо возвращаются в нишу в процессе самообновления 2,3. В дополнение к MuSC, гомеостатическое поддержание и регенерация скелетных мышц полагаются на поддержку популяции мышечных резидентных клеток, называемых фибро-адипогенными предшественниками (FAPs)5,6,7. ФАП представляют собой мезенхимальные стромальные клетки, встроенные в мышечную соединительную ткань и способные дифференцироваться по фиброгенной, адипогенной, остеогенной или хондрогенной линии 5,8,9,10. FAP обеспечивают структурную поддержку MuSC, поскольку они являются источником белков внеклеточного матрикса в нише мышечных стволовых клеток. FAP также способствуют долгосрочному поддержанию скелетных мышц путем секреции цитокинов и факторов роста, которые обеспечивают трофическую поддержку миогенеза и роста мышц 6,11. При остром мышечном повреждении ФАП быстро размножаются, образуя переходную нишу, которая поддерживает структурную целостность регенерирующей мышцы и обеспечивает благоприятную среду для поддержания пролиферации и дифференцировки MUSC паракринным способом5. По мере продолжения регенерации ФАПы очищаются от регенеративной мышцы апоптозом, и их количество постепенно возвращается к базальному уровню12. Однако в условиях, благоприятствующих хроническому повреждению мышц, FAP перекрывают проапоптотическую сигнализацию и накапливаются в мышечной нише, где они дифференцируются в коллаген-продуцирующие фибробласты и адипоциты, что приводит к инфильтратам эктопического жира и образованию фиброзных рубцов12,13.
Из-за их мультипотентности и регенеративных способностей FAP и MuSC были идентифицированы как перспективные мишени в регенеративной медицине для лечения заболеваний скелетных мышц. Поэтому для исследования их функции и терапевтического потенциала важно установить эффективные и воспроизводимые протоколы для выделения и культивирования ФАПов и MUSC.
Флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS) может идентифицировать различные клеточные популяции на основе морфологических характеристик, таких как размер и гранулярность, и позволяет выделять специфические клетки на основе использования антител, направленных против маркеров клеточной поверхности. У взрослых мышей MuSC экспрессируют молекулу адгезии сосудистых клеток 1 (VCAM-1, также известную как CD106)14,15 и α7-интегрин15, в то время как FAP экспрессируют рецептор фактора роста тромбоцитов α (PDGFRα) и антиген стволовых клеток 1 (Sca1 или Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . В описанном здесь протоколе MuSC были идентифицированы как CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, в то время как FAP были идентифицированы как CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Альтернативно, мыши PDGFRαEGFP использовали для выделения FAP как CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-events18,19. Кроме того, мы сравнили перекрытие между флуоресцентным сигналом клеток PDGFRα-GFP+ с клетками, идентифицированными поверхностным маркером Sca1. Наш анализ показал, что все GFP-экспрессирующие клетки также были положительными для Sca1, что указывает на то, что любой подход может быть использован для идентификации и изоляции FAP. Наконец, окрашивание специфическими маркерными антителами подтвердило чистоту каждой клеточной популяции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Создание эффективных и воспроизводимых протоколов для идентификации и изоляции чистых популяций взрослых стволовых клеток является первым и наиболее важным шагом на пути к пониманию их функции. Изолированные FAP и MuSC могут быть использованы для проведения мультиомического анализа в э…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Тома Чунга (Гонконгский университет науки и технологии) за советы по изоляции MuSC. Эта работа финансировалась NIAMS-IRP через гранты NIH AR041126 и AR041164.
Materials
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
Riferimenti
- Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
- Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
- Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
- Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
- Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
- Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
- Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
- Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
- Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
- García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Biologia dello sviluppo. 326 (1), 47-59 (2009).
