FACS-isolamento e coltura di progenitori fibro-adipogeni e cellule staminali muscolari da muscolo scheletrico di topo imperturbato e ferito
Summary
L’identificazione precisa delle cellule progenitrici fibro-adipogeniche (FAP) e delle cellule staminali muscolari (MuSC) è fondamentale per studiare la loro funzione biologica in condizioni fisiologiche e patologiche. Questo protocollo fornisce linee guida per l’isolamento, la purificazione e la coltura di FAP e MuSC da muscoli di topo adulti.
Abstract
Le cellule progenitrici fibro-adipogeniche (FAP) sono una popolazione di cellule stromali mesenchimali (MSC) residenti nel muscolo scheletrico in grado di differenziarsi lungo la linea fibrogenica, adipogena, osteogenica o condrogena. Insieme alle cellule staminali muscolari (MuSC), le FAP svolgono un ruolo fondamentale nell’omeostasi, nella riparazione e nella rigenerazione muscolare, mantenendo e rimodellando attivamente la matrice extracellulare (ECM). In condizioni patologiche, come danni cronici e distrofie muscolari, i FAP subiscono un’attivazione aberrante e si differenziano in fibroblasti e adipociti produttori di collagene, portando alla fibrosi e all’infiltrazione grassa intramuscolare. Pertanto, i FAP svolgono un duplice ruolo nella rigenerazione muscolare, sostenendo il turnover MuSC e promuovendo la riparazione dei tessuti o contribuendo alla formazione di cicatrici fibrotiche e infiltrati di grasso ectopico, che compromettono l’integrità e la funzione del tessuto muscolare scheletrico. Una corretta purificazione di FAP e MuSC è un prerequisito per comprendere il ruolo biologico di queste cellule sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Qui, descriviamo un metodo standardizzato per l’isolamento simultaneo di FAP e MuSC dai muscoli degli arti di topi adulti utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). Il protocollo descrive in dettaglio la dissociazione meccanica ed enzimatica delle cellule mononucleate dai muscoli dell’intero arto e dai muscoli tibiali anteriori (TA) lesionati. FAP e MuSC vengono successivamente isolati utilizzando uno smistatore di cellule semi-automatico per ottenere popolazioni cellulari pure. Descriviamo inoltre un metodo ottimizzato per la coltura di FAP e MuSC quiescenti e attivati, da soli o in condizioni di cocultura.
Introduction
Il muscolo scheletrico è il tessuto più grande del corpo, che rappresenta ~ 40% del peso umano adulto, ed è responsabile del mantenimento della postura, della generazione di movimento, della regolazione del metabolismo energetico basale e della temperatura corporea1. Il muscolo scheletrico è un tessuto altamente dinamico e possiede una notevole capacità di adattarsi a una varietà di stimoli, come stress meccanico, alterazioni metaboliche e fattori ambientali quotidiani. Inoltre, il muscolo scheletrico si rigenera in risposta a lesioni acute, portando al completo ripristino della sua morfologia e delle sue funzioni2. La plasticità del muscolo scheletrico si basa principalmente su una popolazione di cellule staminali muscolari residenti (MuSC), chiamate anche cellule satelliti, che si trovano tra la membrana plasmatica della miofibra e la lamina basale 2,3. In condizioni normali, i MuSC risiedono nella nicchia muscolare in uno stato quiescente, con solo poche divisioni per compensare il turnover cellulare e ricostituire il pool di cellule staminali4. In risposta alle lesioni, le MuSC entrano nel ciclo cellulare, proliferano e contribuiscono alla formazione di nuove fibre muscolari o ritornano nella nicchia in un processo di auto-rinnovamento 2,3. Oltre ai MuSC, il mantenimento omeostatico e la rigenerazione del muscolo scheletrico si basano sul supporto di una popolazione di cellule muscolari residenti denominate progenitori fibro-adipogeni (FAP)5,6,7. Le FAP sono cellule stromali mesenchimali incorporate nel tessuto connettivo muscolare e in grado di differenziarsi lungo la linea fibrogenica, adipogena, osteogenica o condrogena 5,8,9,10. I FAP forniscono supporto strutturale per i MuSC in quanto sono una fonte di proteine della matrice extracellulare nella nicchia delle cellule staminali muscolari. I FAP promuovono anche il mantenimento a lungo termine del muscolo scheletrico secernendo citochine e fattori di crescita che forniscono supporto trofico per la miogenesi e la crescita muscolare 6,11. In caso di lesione muscolare acuta, i FAP proliferano rapidamente per produrre una nicchia transitoria che supporta l’integrità strutturale del muscolo rigenerante e fornisce un ambiente favorevole per sostenere la proliferazione e la differenziazione dei MuSC in modo paracrino5. Man mano che la rigenerazione procede, i FAP vengono eliminati dal muscolo rigenerativo mediante apoptosi e il loro numero ritorna gradualmente al livello basale12. Tuttavia, in condizioni che favoriscono il danno muscolare cronico, i FAP annullano la segnalazione pro-apoptotica e si accumulano nella nicchia muscolare, dove si differenziano in fibroblasti e adipociti che producono collagene, portando a infiltrati di grasso ectopico e formazione di cicatrici fibrotiche12,13.
Grazie alla loro multipotenza e alle loro capacità rigenerative, FAP e MuSC sono stati identificati come potenziali bersagli nella medicina rigenerativa per il trattamento dei disturbi del muscolo scheletrico. Pertanto, per studiare la loro funzione e il potenziale terapeutico, è importante stabilire protocolli efficienti e riproducibili per l’isolamento e la coltura di FAP e MuSC.
La selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) può identificare diverse popolazioni cellulari in base a caratteristiche morfologiche come dimensioni e granularità e consente l’isolamento cellulare specifico basato sull’uso di anticorpi diretti contro i marcatori della superficie cellulare. Nei topi adulti, i MuSC esprimono la molecola di adesione delle cellule vascolari 1 (VCAM-1, nota anche come CD106)14,15 e α7-integrina 15, mentre i FAP esprimono il recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine α (PDGFRα) e l’antigene delle cellule staminali 1 (Sca1 o Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . Nel protocollo qui descritto, i MuSC sono stati identificati come CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, mentre i FAP sono stati identificati come CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. In alternativa, topi PDGFRαEGFP sono stati impiegati per isolare FAP come CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- eventi18,19. Inoltre, abbiamo confrontato la sovrapposizione tra il segnale fluorescente delle cellule PDGFRα-GFP+ alle cellule identificate dal marcatore di superficie Sca1. La nostra analisi ha mostrato che tutte le cellule che esprimono GFP erano anche positive per Sca1, indicando che entrambi gli approcci possono essere impiegati per l’identificazione e l’isolamento delle FAP. Infine, la colorazione con anticorpi marcatori specifici ha confermato la purezza di ciascuna popolazione cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stabilire protocolli efficienti e riproducibili per l’identificazione e l’isolamento di popolazioni di cellule staminali adulte pure è il primo e più critico passo verso la comprensione della loro funzione. Le FAP e le MuSC isolate possono essere utilizzate per condurre analisi multiomiche in esperimenti di trapianto come potenziale trattamento per le malattie muscolari o possono essere geneticamente modificate per la modellizzazione della malattia nella terapia con cellule staminali.
Il pr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Tom Cheung (The Hong Kong University of Science & Technology) per i consigli sull’isolamento MuSC. Questo lavoro è stato finanziato dal NIAMS-IRP attraverso le sovvenzioni NIH AR041126 e AR041164.
Materials
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
Riferimenti
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