Mikrojel Çubuklardan Birbirine Bağlı Makrogözenekli 3D İskeleler
Summary
Tamamlayıcı reaktif gruplara sahip mikrojel çubuklar, sulu çözeltide birbirine bağlanma kabiliyetine sahip mikroakışkanlar yoluyla üretilir. Anizometrik mikrojeller, küresel tabanlı sistemlere kıyasla daha büyük gözeneklere sahip kararlı yapılara sıkışır ve birbirine bağlanır. GRGDS-PC ile modifiye edilmiş mikrojeller, hücre kültürü için kullanılabilecek makrogözenekli 3D yapılar oluşturur.
Abstract
Mikroakışkanlardan gelen iki bileşenli işlevselleştirilmiş mikrojel sistemi, başka katkı maddeleri olmadan sulu çözeltilerde 3D makrogözenekli yapılara hızlı bir şekilde bağlanmayı sağlar. Sürekli foto-başlatılan çip üstü jelasyon, elde edilen yapılar için yapı taşı özelliklerini belirleyen mikrojel en boy oranının varyasyonunu sağlar. Glisidil metakrilat (GMA) veya 2-aminoetil metakrilat (AMA) monomerleri, epoksi veya amin işlevselliği elde etmek için polietilen glikol (PEG) yıldız polimerlerine dayanan mikrojel ağına kopolimerize edilir. İşlevselleştirilmiş mikrojel çubukların sürekli toplanmasını sağlamak için mikroakışkan çıkış yapısına bir odaklama yağı akışı getirilir. Yakın tarihli bir yayına dayanarak, mikrojel çubuk bazlı yapılar birkaç yüz mikrometrelik daha büyük gözeneklerle sonuçlanır ve aynı zamanda küresel tabanlı bir modele kıyasla genel olarak daha yüksek iskele stabilitesine yol açar. Bu sayede ihtiyaç duyulan malzeme miktarını azaltırken daha fazla serbest hacimli daha yüksek hacimli yapılar üretmek mümkündür. Birbirine bağlı makrogözenekli iskeleler hasar görmeden veya parçalanmadan toplanabilir ve taşınabilir. Birbirine bağlanmada yer almayan amin ve epoksi grupları aktif kalır ve modifikasyon sonrası için bağımsız olarak kullanılabilir. Bu protokol, sonraki hücre deneyleri için kullanılabilecek makrogözenekli birbirine bağlı iskeleler oluşturmak için mikrojel çubukların üretimi için optimize edilmiş bir yöntemi açıklamaktadır.
Introduction
3D yapılarda karmaşık işbirlikçi hücre davranışını incelemek için, iskele platformlarının tekrarlanabilirlikte tutarlı performans göstermesi, hücre göçü için uygun geometriye sahip olması ve aynı zamanda canlı doku üzerindeki etkilerini araştırmak için parametre değişikliği açısından belirli bir esnekliğe izin vermesi gerekir1. Son yıllarda, ilk olarak Segura ve ark. tarafından tanımlanan makrogözenekli tavlanmış parçacıklar (MAP) kavramı, 3D iskele üretimi için verimli ve çok yönlü bir platform haline geldi2. Son 3D iskelenin yapı taşları olan mikrojellerin özel bileşimi, yapının sertliği, jel ağının seçici kimyasal reaktivitesi ve iskelenin son gözenek boyutu 2,3,4,5,6 gibi özellikleri önceden tanımlar. İskele-hücre etkileşimleri için ipuçları olarak hücre yapışkan peptitleri, hücre bağlanmasına izin vermek için mikrojellerin polimer ağına dahil edilir ve kültürdeki hücreler üzerindeki spesifik etkilerini araştırmak için değiştirilebilir. 3D iskeleler, kovalent veya supramoleküler bağlar nedeniyle tavlanmış enjekte edilebilir mikrojellerin birbirine bağlanmasıyla stabilize edilir ve hücre kültürü 2,3,5,7,8 için sağlam ve tanımlanmış yapılar elde edilir.
Mikroakışkanlar, tanımlanmış granüler hidrojellerin hazırlanması için en doğru ve uyarlanabilir yöntemlerden biri olarak kendini kanıtlamıştır9. Kimyasal, mekanik ve fiziksel monodispersitelerini korurken sürekli bir süreçte gerekli yapı taşlarının daha büyük miktarlarda üretilmesi olasılığı, bu işlemin uygunluğuna önemli ölçüde katkıda bulunur. Ayrıca, üretilen mikrojellerin boyutu ve şekli, yapı taşlarının geometrisini ve dolayısıyla son iskele1,10’un 3D yapısını belirleyen toplu emülsiyonlar, mikroakışkanlar, litografi, elektrodinamik püskürtme veya mekanik parçalanma gibi çeşitli yöntemlerle manipüle edilebilir.
Son zamanlarda, başka katkı maddesi olmadan sulu çözeltilerde hızla birbirine bağlanan işlevselleştirilmiş mikrojel çubuklardan oluşan makrogözenekli 3D iskeleler kavramı bildirilmiştir11. Mikrojel çubukların anizotropisi, bu çalışmada küresel mikrojellerin kullanılmasına kıyasla daha yüksek gözeneklilikler ve daha büyük gözenek boyutlarına sahip gözenek dağılımları ile sonuçlanmıştır11. Bu şekilde, daha az malzeme, 3D iskelenin stabilitesini korurken çeşitli gözenek geometrilerine sahip daha büyük gözenekler oluşturur. Sistem, birbiriyle temas ettiğinde birbirine bağlanma reaksiyonu içinde tüketilen tamamlayıcı primer amin ve epoksi fonksiyonel gruplarına sahip iki tip mikrojel çubuktan oluşur. Birbirine bağlanma sürecine katılmayan fonksiyonel gruplar aktif kalır ve hücre yapışkan peptitleri veya diğer biyoaktif faktörlerle seçici post-modifikasyon için kullanılabilir. Fibroblast hücreleri, 3D iskelelerin içinde kültürlendiğinde bağlanır, yayılır ve çoğalır, ilk önce mikrojel yüzeyinde büyür ve 5 gün sonra makrogözeneklerin çoğunu doldurur. İnsan fibroblastları ve insan göbek damarı endotel hücrelerinin (HUVEC’ler) ön ko-kültür çalışması, birbirine bağlı 3D iskelelerde damar benzeri yapıların oluşumu için umut verici sonuçlar göstermiştir11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokoldeki kritik adımlardan biri, birincil amin fonksiyonelleştirmesi için komonomer olarak kullanılan 2-aminoetil metakrilatın (AMA) kalitesidir. AMA, gaz geçirmez kahverengi bir cam kapta verilen ince taneli ve tercihen renksiz bir toz olmalıdır. Yeşilimsi ve topaklı malzeme kullanmaktan kaçınılmalıdır, çünkü jelasyon reaksiyonunu önemli ölçüde bozar ve sonuçların tekrarlanabilirliğini olumsuz yönde etkiler. Zayıf jelleşme ve kararsız mikrojel çubuklar durumunda, tedarikçiyi değiş…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu metodolojinin dayandığı önceki çalışmamızın ortak yazarlarına, Céline Bastard, Luis P. B. Guerzoni, Yonca Kittel, Rostislav Vinokur, Nikolai Born ve Tamás Haraszti’ye şükranlarımızı sunuyoruz. Deutsche Forschungsgemeinschaft’ın (DFG) B5 ve C3 SFB 985 “İşlevsel Mikrojeller ve Mikrojel Sistemleri” projesi kapsamında sağladığı fonları minnetle kabul ediyoruz. Leibniz Senatosu Rekabet Komitesi’nin (SAW) Professorinnenprogramm (SAW-2017-PB62: BioMat) kapsamındaki fonlarını kabul ediyoruz. Avrupa Komisyonu’ndan (EUSMI, 731019) gelen fonları içtenlikle kabul ediyoruz. Bu çalışma kısmen AB ve Kuzey Ren-Vestfalya federal eyaleti tarafından desteklenen Kimyasal Polimer Teknolojisi Merkezi’nde (CPT) gerçekleştirildi (hibe EFRE 30 00 883 02).
Materials
| ABIL EM 90 | Evonik | 144243-53-8 | non-ionic surfactant |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride | TCI Chemicals | A3413 | >98.0%(T)(HPLC) |
| 8-Arm PEG-acrylate 20 kDa | Biochempeg Scientific Inc. | A88009-20K | ≥ 95 % |
| AutoCAD 2019 | Autodesk | computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs | |
| CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter | XH49.1 | pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV) | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | type No. 1 | |
| EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm | Electron Microscopy Sciences | 0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter | |
| Ethanol absolut | VWR Chemicals | ||
| FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera | FLIR Systems | ||
| Fluoresceinamine isomer I | Sigma-Aldrich | 201626 | |
| Fluorescein isothiocyanate | Thermo Fisher Scientific | 46424 | |
| 25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles | BD Microlance 3 | ||
| Glycidyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 779342 | ≥97.0% (GC) |
| GRGDS-PC | CPC Scientific | FIBN-015A | |
| Hamilton 1000 Series Gastight syringes | Thermo Fisher Scientific | 10772361/10500052 | PFTE Luer-Lock |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 1,04,367 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Sigma-Aldrich | 900889 | ≥95 % |
| Motic AE2000 trinocular microscope | Ted Pella, Inc. | 22443-12 | |
| Novec 7100 | Sigma-Aldrich | SHH0002 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O9755 | |
| Paraffin | VWR Chemicals | 24679320 | |
| Pavone Nanoindenter Platform | Optics11Life | ||
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade | dropletex | ID 0.38 mm OD 1.09 mm | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | ||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11530586 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow SYLGARD | 634165S | |
| Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| UVC LED sterilizing box | UVLED Optical Technology Co., Ltd. | 9S SZH8-S2 |
Riferimenti
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
- Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Hsu, R. -. S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
- Chen, Z., et al. Advanced microfluidic devices for fabricating multi-structural hydrogel microsphere. Exploration. 1 (3), 20210036 (2021).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
- Guerzoni, L. P. B., et al. Cell encapsulation in soft, anisometric poly(ethylene) glycol microgels using a novel radical-free microfluidic system. Small. 15 (20), 1900692 (2019).
- Krüger, A. J. D., et al. Compartmentalized jet polymerization as a high-resolution process to continuously produce anisometric microgel rods with adjustable size and stiffness. Advanced Materials. 31 (49), 1903668 (2019).
- Darling, N. J., et al. Click by click microporous annealed particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
- Lutzweiler, G., Ndreu Halili, ., Engin Vrana, N. The overview of porous, bioactive scaffolds as instructive biomaterials for tissue regeneration and their clinical translation. Pharmaceutics. 12 (7), 602 (2020).
- Dang, H. P., et al. 3D printed dual macro-, microscale porous network as a tissue engineering scaffold with drug delivering function. Biofabrication. 11 (3), 035014 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
