마이크로젤 로드의 상호 연결된 거대 다공성 3D 스캐폴드
Summary
상보적인 반응성 그룹을 갖는 마이크로겔 로드는 수용액에서 상호 연결될 수 있는 능력을 가진 마이크로유체공학을 통해 생산됩니다. 아니소메트릭 마이크로젤은 구형 기반 시스템에 비해 더 큰 기공을 가진 안정적인 구조물로 막히고 상호 연결됩니다. GRGDS-PC로 변형 된 마이크로 겔은 세포 배양에 사용할 수있는 거대 다공성 3D 구조물을 형성합니다.
Abstract
미세유체공학의 기능화된 마이크로겔의 2액형 시스템은 추가 첨가제 없이 수용액에서 3D 거대 다공성 구조물로 빠르게 상호 연결할 수 있습니다. 연속적인 광개시 온칩 겔화는 마이크로겔 종횡비의 변동을 가능하게 하며, 이는 수득된 구축물에 대한 빌딩 블록 특성을 결정한다. 글리시딜 메타크릴레이트(GMA) 또는 2-아미노에틸 메타크릴레이트(AMA) 단량체는 에폭시 또는 아민 작용기를 달성하기 위해 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 스타 폴리머를 기반으로 하는 마이크로겔 네트워크로 공중합됩니다. 집속 오일 흐름은 기능화된 마이크로겔 로드의 연속 수집을 보장하기 위해 마이크로유체 출구 구조로 도입됩니다. 최근 간행물에 따르면 마이크로겔 로드 기반 구조체는 수백 마이크로미터의 더 큰 기공을 생성하는 동시에 구형 기반 모델에 비해 전반적으로 더 높은 스캐폴드 안정성을 제공합니다. 이러한 방식으로, 필요한 재료의 양을 줄이면서 더 많은 자유 부피를 갖는 더 많은 양의 구조물을 생산할 수 있습니다. 상호 연결된 거대 다공성 스캐폴드는 손상이나 분해 없이 픽업하고 운반할 수 있습니다. 상호 결합에 관여하지 않는 아민 및 에폭시기는 활성 상태를 유지하며 사후 변형을 위해 독립적으로 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 후속 세포 실험에 활용할 수 있는 거대다공성 상호 연결된 스캐폴드를 형성하기 위해 마이크로겔 막대를 제조하기 위한 최적화된 방법을 설명합니다.
Introduction
3D 구조에서 복잡한 협력 세포 거동을 연구하려면 스캐폴드 플랫폼이 재현성에서 일관된 성능을 보여주고, 세포 이동에 적합한 형상을 가져야 하며, 동시에생체 조직에 미치는 영향을 조사하기 위해 매개변수 변경 측면에서 특정 유연성을 허용해야 합니다1. 최근 몇 년 동안 Segura et al.에 의해 처음 기술된 거대다공성 어닐링 입자(MAP)의 개념은 3D 비계 생산을 위한 효율적이고 다양한 플랫폼으로 발전했습니다2. 최종 3D 스캐폴드의 빌딩 블록인 마이크로겔의 맞춤형 구성은 구조물의 강성, 겔 네트워크의 선택적 화학적 반응성 및 스캐폴드 2,3,4,5,6의 최종 공극 크기와 같은 특성을 미리 정의합니다. 스캐폴드-세포 상호작용을 위한 단서로서의 세포 접착 펩티드는 마이크로겔의 중합체 네트워크에 통합되어 세포 부착을 허용하고 배양에서 세포에 대한 이들의 특이적 효과를 조사하기 위해 다양화될 수 있다. 3D 스캐폴드는 공유 결합 또는 초분자 결합으로 인해 어닐링된 주사 가능한 마이크로겔의 상호 결합에 의해 안정화되어 세포 배양 2,3,5,7,8을 위한 견고하고 정의된 구조를 생성합니다.
Microfluidics는 정의 된 과립 하이드로 겔의 제조를위한 가장 정확하고 적응력있는 방법 중 하나로 자리 매김했습니다9. 화학적, 기계적 및 물리적 단분산성을 유지하면서 연속 공정에서 필요한 빌딩 블록을 더 많이 생산할 수 있는 가능성은 이 공정의 적합성에 크게 기여합니다. 더욱이, 생성된 마이크로겔의 크기 및 형상은 배치 에멀젼, 마이크로유체공학, 리소그래피, 전기역학적 분무 또는 기계적 단편화와 같은 다양한 방법에 의해 조작될 수 있으며, 이는 빌딩 블록의 기하학적 구조 및 따라서 최종 스캐폴드(1,10)의 3D 구조를 결정한다.
최근에, 추가 첨가제없이 수용액에서 신속하게 상호 연결되는 기능화 된 마이크로 겔 막대로 구성된 거대 다공성 3D 스캐 폴드의 개념이보고되었다11. 마이크로겔 막대의 이방성은이 연구에서 구형 마이크로겔을 사용하는 것과 비교하여 더 큰 기공 크기를 가진 더 높은 다공성 및 기공 분포를 가져왔습니다11. 이러한 방식으로 재료가 적을수록 3D 스캐폴드의 안정성을 유지하면서 다양한 기공 형상을 가진 더 큰 기공이 생성됩니다. 이 시스템은 서로 접촉 할 때 상호 연결 반응 내에서 소비되는 상보적인 1 차 아민 및 에폭시 작용기를 가진 두 가지 유형의 마이크로 겔 막대로 구성됩니다. 상호 결합 과정에 참여하지 않는 작용기는 활성 상태를 유지하며 세포 접착 펩티드 또는 기타 생리 활성 인자를 사용한 선택적 사후 변형에 사용할 수 있습니다. 섬유아세포는 3D 스캐폴드 내부에서 배양될 때 부착, 확산 및 증식하며, 먼저 마이크로젤 표면에서 성장하고 5일 후에 대부분의 매크로 기공을 채웁니다. 인간 섬유아세포 및 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에 대한 예비 공동배양 연구는 상호 연결된 3D 스캐폴드(11) 내에서 혈관-유사 구조의 형성에 대한 유망한 결과를 보여주었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜의 중요한 단계 중 하나는 1차 아민 기능화를 위한 공단량체로 사용되는 2-아미노에틸 메타크릴레이트(AMA)의 품질입니다. AMA는 기밀 갈색 유리 용기에 전달되는 미세하고 바람직하게는 무색 분말이어야 합니다. 녹색을 띠고 울퉁불퉁 한 물질을 사용하면 겔화 반응이 크게 손상되고 결과의 재현성에 부정적인 영향을 미치므로 사용하지 않아야합니다. 겔화가 불량하고 마이크로 겔 막대…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 이 방법론이 기반으로 하는 이전 작업의 공동 저자인 Céline Bastard, Luis P. B. Guerzoni, Yonca Kittel, Rostislav Vinokur, Nikolai Born, Tamás Haraszti에게 감사를 표합니다. 우리는 프로젝트 B5 및 C3 SFB 985 “기능성 마이크로겔 및 마이크로젤 시스템” 내에서 DFG(Deutsche Forschungsgemeinschaft)의 자금 지원에 감사드립니다. 우리는 Professorinnenprogramm (SAW-2017-PB62 : BioMat)에 따라 라이프니츠 상원 경쟁위원회 (SAW)의 자금 지원을 인정합니다. 우리는 유럽연합 집행위원회(EUSMI, 731019)의 자금 지원을 진심으로 인정합니다. 이 작업은 EU와 노르트라인베스트팔렌 연방주(보조금 EFRE 30 00 883 02)의 지원을 받은 화학 고분자 기술 센터(CPT)에서 부분적으로 수행되었습니다.
Materials
| ABIL EM 90 | Evonik | 144243-53-8 | non-ionic surfactant |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride | TCI Chemicals | A3413 | >98.0%(T)(HPLC) |
| 8-Arm PEG-acrylate 20 kDa | Biochempeg Scientific Inc. | A88009-20K | ≥ 95 % |
| AutoCAD 2019 | Autodesk | computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs | |
| CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter | XH49.1 | pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV) | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | type No. 1 | |
| EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm | Electron Microscopy Sciences | 0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter | |
| Ethanol absolut | VWR Chemicals | ||
| FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera | FLIR Systems | ||
| Fluoresceinamine isomer I | Sigma-Aldrich | 201626 | |
| Fluorescein isothiocyanate | Thermo Fisher Scientific | 46424 | |
| 25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles | BD Microlance 3 | ||
| Glycidyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 779342 | ≥97.0% (GC) |
| GRGDS-PC | CPC Scientific | FIBN-015A | |
| Hamilton 1000 Series Gastight syringes | Thermo Fisher Scientific | 10772361/10500052 | PFTE Luer-Lock |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 1,04,367 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Sigma-Aldrich | 900889 | ≥95 % |
| Motic AE2000 trinocular microscope | Ted Pella, Inc. | 22443-12 | |
| Novec 7100 | Sigma-Aldrich | SHH0002 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O9755 | |
| Paraffin | VWR Chemicals | 24679320 | |
| Pavone Nanoindenter Platform | Optics11Life | ||
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade | dropletex | ID 0.38 mm OD 1.09 mm | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | ||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11530586 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow SYLGARD | 634165S | |
| Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| UVC LED sterilizing box | UVLED Optical Technology Co., Ltd. | 9S SZH8-S2 |
Riferimenti
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