Sammenkoblede makroporøse 3D-stillaser fra mikrogelstenger
Summary
Mikrogelstenger med komplementære reaktive grupper produseres via mikrofluidikk med evne til å knytte seg sammen i vandig løsning. De anisometriske mikrogelene syltetøy og sammenkobling til stabile konstruksjoner med større porer sammenlignet med sfæriske baserte systemer. Mikrogeler modifisert med GRGDS-PC danner makroporøse 3D-konstruksjoner som kan brukes til cellekultur.
Abstract
Et tokomponentsystem av funksjonaliserte mikrogeler fra mikrofluidikk muliggjør rask sammenkobling til 3D-makroporøse konstruksjoner i vandige løsninger uten ytterligere tilsetningsstoffer. Kontinuerlig fotoinitiert gelering på brikken muliggjør variasjon av mikrogel-sideforholdet, som bestemmer byggeblokkegenskapene for de oppnådde konstruksjonene. Glycidylmetakrylat (GMA) eller 2-aminoetylmetakrylatmonomerer (AMA) kopolymeriseres i mikrogelnettverket basert på polyetylenglykol (PEG) stjernepolymerer for å oppnå enten epoksy- eller aminfunksjonalitet. En fokuserende oljestrøm føres inn i den mikrofluidiske utløpsstrukturen for å sikre kontinuerlig oppsamling av de funksjonaliserte mikrogelstengene. Basert på en nylig publikasjon resulterer mikrogelstangbaserte konstruksjoner i større porer på flere hundre mikrometer og fører samtidig til generell høyere stillasstabilitet sammenlignet med en sfærisk basert modell. På denne måten er det mulig å produsere konstruksjoner med høyere volum med mer fritt volum samtidig som mengden materiale som kreves reduseres. De sammenkoblede makroporøse stillasene kan hentes og transporteres uten skade eller oppløsning. Amin- og epoksygrupper som ikke er involvert i sammenkobling, forblir aktive og kan brukes uavhengig for ettermodifisering. Denne protokollen beskriver en optimalisert metode for fremstilling av mikrogelstenger for å danne makroporøse sammenkoblede stillaser som kan brukes til påfølgende celleforsøk.
Introduction
For å studere kompleks kooperativ celleoppførsel i 3D-konstruksjoner, må stillasplattformer vise konsistent ytelse i reproduserbarhet, ha egnet geometri for cellemigrasjon, og samtidig tillate viss fleksibilitet når det gjelder parameterendring for å undersøke deres innflytelse på levende vev1. I de senere år har konseptet makroporøse glødede partikler (MAP), først beskrevet av Segura et al., utviklet seg til en effektiv og allsidig plattform for 3D-stillasproduksjon2. Den skreddersydde sammensetningen av mikrogelene, som er byggesteinene i det endelige 3D-stillaset, forhåndsdefinerer egenskaper som stivheten i konstruksjonen, den selektive kjemiske reaktiviteten til gelnettverket og den endelige porestørrelsen på stillaset 2,3,4,5,6. Celleklebende peptider som signaler for stillascelleinteraksjoner er innlemmet i polymernettverket til mikrogelene for å tillate cellefeste og kan varieres for å undersøke deres spesifikke effekter på celler i kultur. 3D-stillasene stabiliseres ved sammenkobling av glødede injiserbare mikrogeler på grunn av kovalente eller supramolekylære bindinger, noe som resulterer i robuste og definerte konstruksjoner for cellekultur 2,3,5,7,8.
Mikrofluidikk har etablert seg som en av de mest nøyaktige og tilpasningsdyktige metodene for fremstilling av definerte granulære hydrogeler9. Muligheten for å produsere større mengder av de nødvendige byggesteinene i en kontinuerlig prosess samtidig som deres kjemiske, mekaniske og fysiske monodispersitet opprettholdes, bidrar vesentlig til egnetheten til denne prosessen. Videre kan størrelsen og formen på de produserte mikrogelene manipuleres ved hjelp av forskjellige metoder som batchemulsjoner, mikrofluidikk, litografi, elektrodynamisk sprøyting eller mekanisk fragmentering, som bestemmer geometrien til byggesteinene og dermed 3D-strukturen til det endelige stillaset 1,10.
Nylig har begrepet makroporøse 3D-stillas sammensatt av funksjonaliserte mikrogelstenger som raskt knytter seg sammen i vandige løsninger uten ytterligere tilsetningsstoffer, blitt rapportert11. Anisotropien til mikrogelstenger resulterte i høyere porøsiteter og porefordelinger med større porestørrelser sammenlignet med bruk av sfæriske mikrogeler i denne studien11. På denne måten skaper mindre materiale større porer med en rekke forskjellige poregeometrier, samtidig som stabiliteten til 3D-stillaset opprettholdes. Systemet består av to typer mikrogelstenger med komplementære primære amin- og epoksyfunksjonelle grupper som forbrukes innenfor den sammenbindende reaksjonen når de kommer i kontakt med hverandre. De funksjonelle gruppene som ikke deltar i sammenkoblingsprosessen forblir aktive og kan brukes til selektiv ettermodifisering med celleklebende peptider eller andre bioaktive faktorer. Fibroblastceller fester, sprer seg og sprer seg når de dyrkes inne i 3D-stillasene, vokser først på mikrogeloverflaten og fyller de fleste makroporene etter 5 dager. En foreløpig samkulturstudie av humane fibroblaster og humane navlestrengendotelceller (HUVECs) viste lovende resultater for dannelsen av fartøylignende strukturer innenfor de sammenkoblede 3D-stillasene11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Et av de kritiske trinnene i denne protokollen er kvaliteten på 2-aminoetylmetakrylatet (AMA) som brukes som komonomer for primær aminfunksjonalisering. AMA skal være et finkornet og helst fargeløst pulver levert i en gasstett brun glassbeholder. Man bør unngå å bruke grønt og klumpete materiale, da det svekker geleringsreaksjonen betydelig og påvirker reproduserbarheten av resultatene negativt. Ved dårlig gelering og ustabile mikrogelstenger kan man vurdere å bytte leverandør.
Hvi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi uttrykker vår takknemlighet til medforfatterne av vårt tidligere arbeid denne metoden er basert på, Céline Bastard, Luis PB Guerzoni, Yonca Kittel, Rostislav Vinokur, Nikolai Born og Tamás Haraszti. Vi takker for finansiering fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) innenfor prosjektet B5 og C3 SFB 985 “Functional Microgels and Microgel Systems”. Vi anerkjenner finansiering fra Leibniz Senate Competition Committee (SAW) under Professorinnenprogramm (SAW-2017-PB62: BioMat). Vi anerkjenner finansiering fra EU-kommisjonen (EUSMI, 731019). Dette arbeidet ble delvis utført ved Center for Chemical Polymer Technology (CPT), som ble støttet av EU og den føderale delstaten Nordrhein-Westfalen (tilskudd EFRE 30 00 883 02).
Materials
| ABIL EM 90 | Evonik | 144243-53-8 | non-ionic surfactant |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride | TCI Chemicals | A3413 | >98.0%(T)(HPLC) |
| 8-Arm PEG-acrylate 20 kDa | Biochempeg Scientific Inc. | A88009-20K | ≥ 95 % |
| AutoCAD 2019 | Autodesk | computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs | |
| CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter | XH49.1 | pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV) | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | type No. 1 | |
| EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm | Electron Microscopy Sciences | 0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter | |
| Ethanol absolut | VWR Chemicals | ||
| FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera | FLIR Systems | ||
| Fluoresceinamine isomer I | Sigma-Aldrich | 201626 | |
| Fluorescein isothiocyanate | Thermo Fisher Scientific | 46424 | |
| 25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles | BD Microlance 3 | ||
| Glycidyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 779342 | ≥97.0% (GC) |
| GRGDS-PC | CPC Scientific | FIBN-015A | |
| Hamilton 1000 Series Gastight syringes | Thermo Fisher Scientific | 10772361/10500052 | PFTE Luer-Lock |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 1,04,367 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Sigma-Aldrich | 900889 | ≥95 % |
| Motic AE2000 trinocular microscope | Ted Pella, Inc. | 22443-12 | |
| Novec 7100 | Sigma-Aldrich | SHH0002 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O9755 | |
| Paraffin | VWR Chemicals | 24679320 | |
| Pavone Nanoindenter Platform | Optics11Life | ||
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade | dropletex | ID 0.38 mm OD 1.09 mm | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | ||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11530586 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow SYLGARD | 634165S | |
| Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| UVC LED sterilizing box | UVLED Optical Technology Co., Ltd. | 9S SZH8-S2 |
Riferimenti
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
- Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Hsu, R. -. S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
- Chen, Z., et al. Advanced microfluidic devices for fabricating multi-structural hydrogel microsphere. Exploration. 1 (3), 20210036 (2021).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
- Guerzoni, L. P. B., et al. Cell encapsulation in soft, anisometric poly(ethylene) glycol microgels using a novel radical-free microfluidic system. Small. 15 (20), 1900692 (2019).
- Krüger, A. J. D., et al. Compartmentalized jet polymerization as a high-resolution process to continuously produce anisometric microgel rods with adjustable size and stiffness. Advanced Materials. 31 (49), 1903668 (2019).
- Darling, N. J., et al. Click by click microporous annealed particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
- Lutzweiler, G., Ndreu Halili, ., Engin Vrana, N. The overview of porous, bioactive scaffolds as instructive biomaterials for tissue regeneration and their clinical translation. Pharmaceutics. 12 (7), 602 (2020).
- Dang, H. P., et al. 3D printed dual macro-, microscale porous network as a tissue engineering scaffold with drug delivering function. Biofabrication. 11 (3), 035014 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
