Summary
Dit artikel beschrijft een techniek voor snelle menselijke temporale botsectie die een microzaag met dubbele diamantbladen gebruikt om dunne plakjes te genereren voor snelle ontkalking en analyse van temporale botimmunohistochemie.
Abstract
Histopathologische analyse van menselijke temporale botsecties is een fundamentele techniek voor het bestuderen van binnen- en middenoorpathologie. Temporale botsecties worden voorbereid door postmortale temporale botoogst, fixatie, ontkalking, inbedding en kleuring. Vanwege de dichtheid van het temporale bot is ontkalking een tijdrovend en grondstofintensief proces; volledige weefselvoorbereiding kan gemiddeld 9-10 maanden duren. Dit vertraagt otopathologisch onderzoek en belemmert tijdgevoelige studies, zoals die relevant zijn voor de COVID-19-pandemie. Dit artikel beschrijft een techniek voor de snelle voorbereiding en ontkalking van temporale botsecties om de weefselverwerking te versnellen.
Temporale botten werden postmortaal geoogst met behulp van standaardtechnieken en gefixeerd in 10% formaline. Een precisie microzaag met dubbele diamantbladen werd gebruikt om elke sectie in drie dikke secties te snijden. Dikke temporale botsecties werden vervolgens gedurende 7-10 dagen ontkalkt in ontkalkingsoplossing voordat ze werden ingebed in paraffine, gesneden in dunne (10 μm) secties met behulp van een cryotoom en gemonteerd op niet-geladen dia's. Weefselmonsters werden vervolgens gedeparaffineerd en gerehydrateerd voor antilichaamkleuring (ACE2, TMPRSS2, Furin) en in beeld gebracht. Deze techniek verkortte de tijd van oogst tot weefselanalyse van 9-10 maanden tot 10-14 dagen. Snelle temporele botsectie kan de snelheid van otopathologisch onderzoek verhogen en de middelen verminderen die nodig zijn voor weefselvoorbereiding, terwijl ook tijdgevoelige studies zoals die met betrekking tot COVID-19 worden vergemakkelijkt.
Introduction
Menselijk temporeel botonderzoek biedt een onschatbare bron om de pathologie en pathofysiologie van het binnen- en middenoor te bestuderen. Vóór de 19e eeuw was er weinig bekend over otologische ziekte 1,2,3. Om otologische ziekten beter te begrijpen en "auditieve chirurgie uit de handen van kwakzalvers te redden", ontwikkelde Joseph Toynbee (1815-1866) methoden om histologische delen van het menselijke temporale bot te bestuderen3. Dit werk werd bevorderd door Adam Politzer (1835-1920) in Wenen en anderen in heel Europa gedurende de rest van de 19e eeuw, die temporale botsecties gebruikte om de histopathologie van veel voorkomende aandoeningen van het oor te beschrijven 2,3,4.
Het eerste laboratorium voor menselijke temporale botten in de Verenigde Staten werd in 1927 geopend in het Johns Hopkins Hospital, waar Stacy Guild (1890-1966) methoden ontwikkelde voor temporale botsectie 5,6. De door Guild ontwikkelde methoden bestonden uit een proces van 9-10 maanden met postmortale oogst, fixatie, ontkalking in salpeterzuur, dehydratie in ethanol, celloidine-inbedding, sectie, kleuring en montage. Wijzigingen in deze techniek werden later aangebracht door Harold Schuknecht (1917-1996)7; de basiscomponenten van dit proces blijven echter in wezen ongewijzigd.
De aanzienlijke middelen die nodig zijn om een laboratorium voor temporale botten te onderhouden, hebben een uitdaging gevormd voor tijdelijk botonderzoek en hebben waarschijnlijk bijgedragen aan de afnemende populariteit ervan in de afgelopen 30 jaar 4,8. Een aanzienlijk deel van de temporale botlaboratoriumbronnen moet worden besteed aan het 9-10 maanden durende proces van temporele botvoorbereiding. Een van de meest tijdrovende stappen in de voorbereiding is de ontkalking van het temporale bot, het dichtste bot in het menselijk lichaam. Ontkalking wordt meestal uitgevoerd in salpeterzuur of ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en duurt weken tot maanden, terwijl de frequente verandering van oplossingenvereist 7,9. Verder kunnen tijdgevoelige studies van het menselijk oor, zoals die met betrekking tot de COVID-19-pandemie, worden belemmerd door dit langzame voorbereidingsproces. Dit artikel beschrijft een techniek voor snelle temporele botsectie die een diamantmicrozaag gebruikt om dikke secties te genereren die snelle ontkalking en weefselanalyse mogelijk maken binnen 10-14 dagen na de tijdelijke botoogst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol is ontwikkeld met goedkeuring van de IRB (IRB00250002) en in overeenstemming met het institutionele beleid voor het gebruik van menselijk weefsel en infectieus materiaal. Elke temporale botdonor gaf schriftelijke toestemming voor het overlijden, of toestemming werd postuum verkregen van de familie van de donor. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt.
1. Tijdelijke botoogst
- Verkrijg de goedkeuring van de lokale institutionele beoordelingsraad (IRB), beoordeel het institutionele beleid voor het gebruik van menselijk en infectieus materiaal en verkrijg toestemming voor weefseldonatie voordat u dit protocol gebruikt.
- Trek de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) aan voordat u werkt met weefsel van COVID-19-positieve temporale botdonoren. Zorg ervoor dat het PBM bestaat uit een N-95 gasmasker en gezichtsscherm (of als alternatief een positieve druk luchtzuiveringssysteem), een toga en twee paar handschoenen. Bekijk technieken voor het correct aantrekken en doseren van PBM's voordat u met dit protocol begint10.
- Oogst tijdelijk botweefsel binnen 12-24 uur na donordood. Als het lichaam niet wordt gekoeld, zorg er dan voor dat de oogst binnen 8 uur na overlijden plaatsvindt.
- Oogst temporale botten tijdens autopsie met behulp van de vier-incisie, blokmethode door osteotome7.
- Verwijder na craniotomie de hersenen en verdeel de hersenzenuwen scherp naar de interne gehoorgang.
- Maak de eerste benige incisie met de osteotome parallel aan en net mediaal aan het plaveiselgedeelte van het temporale bot.
- Voer de tweede benige incisie parallel aan de eerste uit aan de mediale rand van het temporale bot.
- Maak vervolgens de derde incisie 3-4 cm voor en parallel aan de petrousrug.
- Maak de vierde incisie ongeveer evenwijdig aan de derde, 2 cm na de petrousrug.
OPMERKING: Zorg ervoor dat alle incisies zich door de schedelbasis uitstrekken. - Verwijder vervolgens het temporale bot met behulp van scherpe dissectie om de aanhechting van zacht weefsel langs de inferieure rand van het monster te bevrijden. Als balseming moet worden uitgevoerd na de tijdelijke botoogst, bindt u de stronk van de halsslagader af.
- Oogst temporale botten tijdens autopsie met behulp van de vier-incisie, blokmethode door osteotome7.
2. Weefselfixatie, ontkalking en secties
- Plaats het weefsel onmiddellijk in 200-300 ml 10% gebufferd formaline (formaldehyde) zodat het weefsel volledig wordt ondergedompeld. Laat het weefsel minimaal 72 uur in formaldehyde bij kamertemperatuur en verander de oplossingen dagelijks. Bewaar het weefsel in een luchtdichte container en voer oplossingsveranderingen uit onder een zuurkast terwijl u de juiste PBM's draagt om verspreiding van het virus te voorkomen.
OPMERKING: Na de fixatieperiode van 72 uur hoeven de monsters niet langer als besmettelijk te worden beschouwd. - Gebruik een precisiemicrozaag met dubbele diamantbladen om elk monster in drie "dikke" secties te snijden om een snellere weefselontkalking mogelijk te maken. Zet de dubbele diamantbladen op een afstand van 5 mm, zodat het centrale deel van het temporale bot 5 mm dik is. Zorg ervoor dat de delen van het weefsel aan beide uiteinden 3-5 mm dik zijn.
- Plaats de dikke delen in 200-300 ml van 23% w / w mierenzuur ontkalkende oplossing gedurende 7-10 dagen bij kamertemperatuur, totdat het weefsel zacht genoeg is voor paraffine-inbedding. Verander de oplossingen dagelijks. Controleer op voldoende weefselontkalking door het monster te palperen, dat zacht moet aanvoelen.
OPMERKING: Ontkalking kan ook worden geverifieerd door middel van röntgenfoto's. - Spoel de monsters gedurende 24 uur in stromend leidingwater door ze in een grote beker onder een lopende kraan te plaatsen.
- Droog het weefsel uit in een reeks alcoholen met toenemende concentratie7. Dompel het weefsel onder in 100-200 ml 70% ethanol gedurende 1,5 uur, gevolgd door drie wasbeurten in respectievelijk 95% en 100% ethanol gedurende 1,5 uur. Was vervolgens de tissue 3 x 1,5 uur in Xyleen.
- Integreer de dikke delen in paraffine, met vier behandelingen van elk 45 minuten.
- Gebruik een cryotoom om dunne (10 μm) secties te snijden. Plaats het weefsel zo dat het weefsel in het axiale vlak wordt gesneden. Snijd indien gewenst dikkere (20 μm) secties.
3. Immunohistochemie en beeldvorming
- Als traditionele hematoxyline- en eosinekleuring gewenst is (hier niet beschreven), voer dan vlekken uit voordat u de secties op glasplatenmonteert 7.
- Monteer de secties op positief geladen glazen dia's.
- Bak de glaasjes op een hete plaat op 60 °C gedurende 20 min.
- Plaats de dia's in een houder en dompel ze onder in een commerciële voorbehandelingsoplossing die een organisch oplosmiddel (diethanolamine in dit geval) en ethanol bevat om het weefsel te deparaffiniseren, rehydrateren en ontmaskeren.
OPMERKING: Deze stap is nodig om bevredigende resultaten te bereiken met immunohistochemie voor formaline-gefixeerd en paraffine-ingebed weefsel. - Verwarm de glaasjes in een snelkookpan op hoge druk gedurende 20 min.
- Plaats de dia's in een bevochtigde kamer en blokkeer het weefsel met een commerciële blokkeringsoplossing.
- Onderzoek de weefselsecties met het primaire antilichaam tegen angiotensine-converterend enzym 2 (ACE2; 1:50), transmembraanprotease serine 2 (TMPRSS2, 1:1.000) en het Furin-protease (1:250).
OPMERKING: De ACE2-, TMPRSS2- en Furin-antilichamen worden gebruikt omdat wordt aangenomen dat deze eiwitten een rol spelen bij SARS-CoV-2-infectiviteit11,12, en dit protocol probeerde de mogelijke mechanismen te onderzoeken waarmee SARS-CoV-2 het middenoor kan infecteren13. - Behandelen met HRP-geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam (ACE2, Furin; 1:100 verdunning) of anti-geit (TMPRSS2, 1:100 verdunning) secundair antilichaam.
- Bedek de dia's met 70% hematoxyline in water.
- Verkrijg beelden op een lichtmicroscoop met een gemonteerde digitale camera. Verkrijg afbeeldingen van het middenoorslijmvlies en de buis van Eustachius met respectievelijk 20x en 10x vergroting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hematoxyline- en eosinekleuring van het middenoorslijmvlies en de buis van Eustachius toonde behoud van het middenoorslijmvlies en submucosaal middenoorweefsel na verwerking (figuur 1). Immunohistochemische beelden toonden expressie van de ACE2-, TMPRSS2- en Furin-eiwitten in het middenoorslijmvlies en de buis van Eustachius (figuur 1). De aanwezigheid van deze eiwitten in het middenoor biedt een mogelijke route waardoor SARS-CoV-2 het respiratoire epitheel in het middenoor kan infecteren 11,12,13. Verder kan de expressie van deze eiwitten in de buis van Eustachius een route verklaren waarmee het virus het middenoor binnenkomt en via de buis van Eustachius naar het middenoor reist.
Figuur 1: Voorbeeld van gekleurd middenoorweefsel. De figuur toont hematoxyline en eosine, ACE2, TMPRSS2 en Furin-kleuring van het middenoorslijmvlies (bovenste rij, 20x vergroting) en de buis van Eustachius (onderste rij, 10x vergroting). Schaalstaven = 50 μm (bovenste rij); 100 μm (onderste rij). Afkortingen: H&E = hematoxyline en eosine; angiotensine-converterend enzym 2; TMPRSS2 = transmembraanprotease, serine 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Menselijk temporeel botonderzoek is van cruciaal belang voor het bestuderen van binnen- en middenoorpathologie, maar blijft een tijd- en resource-intensieve onderneming. Dit artikel beschrijft een techniek die een diamantmicrozaag gebruikt om dikke temporale botsecties te genereren die snel kunnen worden ontkalkt voordat ze verder worden gesneden, zodat de tijd van weefseloogst tot studie kan worden teruggebracht van 9-10 maanden tot 10-14 dagen. Deze techniek kan de middelen die nodig zijn voor temporele botverwerking verminderen en tijdgevoelige studies vergemakkelijken, zoals die met betrekking tot COVID-19 midden- en binnenoorpathologie13, wat de motivatie was voor het ontwikkelen van dit protocol. Dit protocol maakte de visualisatie van ACE2,TMPRS22 en Furin-expressie in het middenoor en de buis van Eustachius mogelijk, wat een waarschijnlijk mechanisme biedt waarmee SARS-CoV-2 het middenoor kan infecteren door zich vanuit de nasopharynx door de buis van Eustachius te verspreiden.
De primaire innovatie van dit protocol is het gebruik van een diamantzaag die het weefsel snijdt vóór ontkalking, die "dikke" delen van het temporale bot genereert die snel kunnen worden ontkalkt door het oppervlak van het weefsel dat wordt blootgesteld aan het ontkalkingsmiddel te vergroten. Deze stap zorgt ervoor dat weefselontkalking binnen 7-10 dagen kan plaatsvinden in plaats van de 1-2 maanden die traditionele protocollen nodig kunnen hebben voor ontkalking. De "dikke" delen van het weefsel die met de diamantzaag zijn gemaakt, kunnen ook sneller worden uitgedroogd dan een standaard blok tijdelijk botweefsel, waardoor de tijd tussen ontkalking en inbedding wordt verkort. Verder gebruikt dit protocol paraffine als inbeddingsmiddel in plaats van celloïdine, dat ongeveer 3 maanden nodig heeft om uit te harden7. Terwijl celloïdine zorgt voor een superieur behoud van cochleaire structuren, verhardt paraffine veel sneller en vergemakkelijkt immunostaining. Met deze modificaties kan temporale botweefsel in 10-14 dagen worden verwerkt in tegenstelling tot de 9-10 maanden die nodig zijn in meer traditionele verwerkingsstrategieën 7,9.
Dit protocol heeft verschillende beperkingen. Het afsnijden van het weefsel met de diamantzaag voor het insluiten riskeert het beschadigen van het orgaan van Corti (OOC). De OOC werd bij de meeste exemplaren ernstig beschadigd tijdens de ontwikkeling van deze techniek, wat de waarde van deze techniek voor het bestuderen van pathologieën zoals leeftijdsgebonden gehoorverlies kan beperken, waarbij het van vitaal belang is dat de delicate structuren van het binnenoor behouden blijven. Het kan mogelijk zijn om het monster zo te positioneren dat de diamantzaag niet direct door het bot van de otische capsule snijdt en de binnenoorstructuren behoudt, maar dit blijft een gebied van actief onderzoek. Diermodellen kunnen een waardevol hulpmiddel zijn om dit protocol verder te verfijnen en de kans op het behoud van binnenoorstructuren in deze waardevolle menselijke exemplaren te vergroten. De weefselkwaliteit in dit protocol wordt bovendien beperkt door het gebruik van het paraffine-inbeddingsmiddel, dat werd geselecteerd vanwege tijdgebrek. Celloidine-inbedding behoudt beter de cellulaire integriteit in otopathologische exemplaren, maar het duurt maanden om uit te harden7. Ten slotte vereist dit protocol nog steeds aanzienlijke tijd- en middeleninvesteringen. Het gebruik van een diamantmicrozaag is een extra kost voor de materialen die nodig zijn voor traditionele temporele botbereiding, en de 7-10 dagen die nodig zijn voor ontkalking is nog steeds lang. In de toekomst kan het mogelijk zijn om deze methoden te combineren met microgolfondersteunde ontkalking14 om de verwerkingstijd verder te verkorten.
Ondanks zijn beperkingen biedt het hier beschreven protocol voor snelle temporele botverwerking een ander hulpmiddel voor het bestuderen van pathologie van het middenoor en mogelijk het binnenoor. Deze techniek is nuttig geweest tijdens de COVID-19-pandemie en kan ook de kosten verminderen die gepaard gaan met het onderhouden van een actief tijdelijk botlaboratorium door de tijd en arbeid die nodig zijn voor weefselverwerking te verminderen. Temporale botonderzoek is in populariteit afgenomen in de Verenigde Staten, afnemend van 28 actieve laboratoria in de jaren 1980 tot slechts 4 actieve laboratoria op dit moment4. Deze daling van het aantal operationele temporale botlaboratoria kan verband houden met de aanzienlijke kosten die gepaard gaan met het oogsten en verwerken van temporale botten 4,8. Daarom is het belangrijk dat we ernaar streven technieken te ontwikkelen die de middelen verminderen die nodig zijn voor temporele botverwerking en ook die welke de studie van temporale botpathologie in nieuwe contexten mogelijk maken, zoals de COVID-19-pandemie. Verder kan snelle weefselverwerking, zoals beschreven in dit protocol, helpen bij het gebruik van nieuwe biologische technieken (bijv. Immunohistochemie, transcriptomica) die de beoordeling van midden- en binnenoorpathologie op moleculair niveau mogelijk maken 15,16,17,18,19 . We hebben nauwelijks het oppervlak bekrast in termen van het gebruik van moleculaire technieken om menselijk weefsel bij otologische ziekten te bestuderen, en ze kunnen belangrijke inzichten opleveren die niet door diermodellen kunnen worden geleverd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Wij danken Mohamed Lehar voor zijn hulp bij dit project. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (T32DC000027, NSA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet - 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
References
- Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
- Pappas, D. G.
- Schuknecht, H. F. Otopathology: The past, present, and future. Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).
- Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives. Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).
- Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. Observations on the pathology of high-tone deafness. Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480 (1934).
- Andresen, N. S., et al. Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States. Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).
- Schuknecht, H. Pathology of the Ear. , Lea and Febiger. Philadelphia, PA. (1993).
- Chole, R. A. Labs in crisis: Protecting the science--and art--of otopathology. Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).
- Nager, G. T. Pathology of the Ear and Temporal Bone. , Williams and Wilkins. Baltimore, MD. (1993).
- COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE). , Available from: https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html (2022).
- Essalmani, R., et al. Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity. Journal of Virology. 96 (8), 0012822 (2022).
- Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans. Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).
- Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery. JAMA Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).
- Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. Microwave decalcification of human temporal bones. Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).
- Stephenson, R., et al. Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear. Hearing Research. 400, 108113 (2021).
- McCall, A. A., et al.
- Wu, P. Z., O'Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them. The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).
- Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).
- Lopez, I. A., et al. Immunohistochemical techniques for the human inner ear. Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).
