Summary
Este artigo descreve uma técnica para seção óssea temporal humana rápida que utiliza uma microsaw com lâminas de diamante gêmeos para gerar fatias finas para descalcificação rápida e análise da imunohistoquímica óssea temporal.
Abstract
A análise histopatológica das seções ósseas temporais humanas é uma técnica fundamental para estudar a patologia do ouvido interno e médio. As seções ósseas temporais são preparadas pela colheita óssea temporal pós-morte, fixação, decalcificação, incorporação e coloração. Devido à densidade do osso temporal, a decalcificação é um processo demorado e intensivo em recursos; a preparação completa do tecido pode levar de 9 a 10 meses em média. Isso retarda a pesquisa de otopatologia e dificulta estudos sensíveis ao tempo, como os relevantes para a pandemia COVID-19. Este artigo descreve uma técnica para a rápida preparação e descalcificação das seções ósseas temporais para acelerar o processamento tecidual.
Os ossos temporais foram colhidos após a morte usando técnicas padrão e fixados em 10% de formalina. Uma microsserra de precisão com lâminas de diamante gêmeo foi usada para cortar cada seção em três seções grossas. Seções ósseas temporais espessas foram então descalcificadas em solução decalcificante por 7-10 dias antes de serem incorporadas em parafina, seccionadas em seções finas (10 μm) usando um criotome, e montadas em slides não sobrecarregados. As amostras de tecido foram então desparafinadas e rehidratadas para coloração de anticorpos (ACE2, TMPRSS2, Furin) e imagens. Esta técnica reduziu o tempo da colheita para a análise tecidual de 9-10 meses para 10-14 dias. A seção óssea temporal de alta velocidade pode aumentar a velocidade da pesquisa de otopatologia e reduzir os recursos necessários para a preparação de tecidos, ao mesmo tempo em que facilita estudos sensíveis ao tempo, como os relacionados ao COVID-19.
Introduction
A pesquisa óssea temporal humana fornece um recurso inestimável para estudar a patologia e a fisiopatologia do ouvido interno e médio. Antes do século XIX, pouco se sabia sobre a doença otológica 1,2,3. Para entender melhor a doença otológica e "resgatar cirurgias aurais das mãos de charlatões", Joseph Toynbee (1815-1866) desenvolveu métodos para estudar seções histológicas do osso temporal humano3. Este trabalho foi apresentado por Adam Politzer (1835-1920) em Viena e outros em toda a Europa durante o restante do século XIX, que usou seções ósseas temporais para descrever a histopatologia de muitas condições comuns que afetam o ouvido 2,3,4.
O primeiro laboratório de osso temporal humano nos Estados Unidos foi aberto em 1927 no Hospital Johns Hopkins, onde Stacy Guild (1890-1966) desenvolveu métodos para seçãoóssea temporal 5,6. Os métodos desenvolvidos pela Guild consistia em um processo de 9 a 10 meses que incluía colheita pós-morte, fixação, decalcificação no ácido nítrico, desidratação no etanol, incorporação de celoidina, secção, coloração e montagem. Modificações nesta técnica foram posteriormente feitas por Harold Schuknecht (1917-1996)7; no entanto, os componentes básicos desse processo permanecem essencialmente inalterados.
Os recursos significativos necessários para a manutenção de um laboratório ósseo temporal apresentaram um desafio para a pesquisa óssea temporal e provavelmente contribuíram para sua popularidade em declínio nos últimos 30 anos 4,8. Uma parcela significativa dos recursos do laboratório ósseo temporal deve ser dedicada ao processo de 9-10 meses de preparação óssea temporal. Um dos passos mais demorados na preparação é a decalcificação do osso temporal, que é o osso mais denso do corpo humano. A decalcificação é tipicamente realizada em ácido nítrico ou ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA) e leva semanas a meses, exigindo a mudança frequente das soluções 7,9. Além disso, estudos sensíveis ao tempo do ouvido humano, como os relacionados à pandemia COVID-19, podem ser dificultados por esse lento processo de preparação. Este artigo descreve uma técnica para seção óssea temporal de alta velocidade que usa uma microsaw de diamante para gerar seções grossas que permitem descalcificação rápida e análise de tecidos dentro de 10-14 dias após a colheita óssea temporal.
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Protocol
Este protocolo foi desenvolvido com aprovação do IRB (IRB00250002) e de acordo com as políticas institucionais de uso de tecido humano e material infeccioso. Cada doador ósseo temporal forneceu consentimento por escrito antes da morte, ou o consentimento foi obtido postumamente da família do doador. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, equipamentos e softwares utilizados neste protocolo.
1. Colheita óssea temporal
- Obtenha aprovação do conselho do Conselho de Revisão Institucional Local (IRB), revise políticas institucionais para o uso de material humano e infeccioso e obtenha consentimento para doação de tecidos antes de utilizar esse protocolo.
- Coloque equipamentos de proteção individual (EPI) adequados antes de trabalhar com tecido de doadores de ossos temporais covid-19 positivos. Certifique-se de que o EPI consiste em um respirador N-95 e um escudo facial (ou, alternativamente, um sistema de purificação de ar de pressão positiva), vestido e dois pares de luvas. Revise técnicas para doar e doffing adequadamente EPI antes de iniciar este protocolo10.
- Colher tecido ósseo temporal dentro de 12-24 h da morte do doador. Se o corpo não estiver refrigerado, certifique-se de que a colheita ocorra dentro de 8h após a morte.
- Colher ossos temporais durante a autópsia usando o método de quatro incisões, bloco por osteotome7.
- Após a craniotomia, remova o cérebro e divida os nervos cranianos para o canal auditivo interno bruscamente.
- Faça a primeira incisão óssea com o osteotome paralelo e apenas medial à porção escânica do osso temporal.
- Realize a segunda incisão óssea paralela à primeira na borda medial do osso temporal.
- Em seguida, faça a terceira incisão 3-4 cm anterior e paralela à crista petros.
- Faça a quarta incisão aproximadamente paralela à terceira, 2 cm posterior à crista petros.
NOTA: Certifique-se de que todas as incisões se estendem através da base do crânio. - Em seguida, remova o osso temporal usando dissecção afiada para liberar o acessório do tecido mole ao longo da borda inferior da amostra. Se o embalsamamento for realizado após a colheita óssea temporal, amarre o toco da artéria carótida.
- Colher ossos temporais durante a autópsia usando o método de quatro incisões, bloco por osteotome7.
2. Fixação tecidual, decalcificação e secção
- Coloque imediatamente o tecido em 200-300 mL de formalina tamponada de 10% (formaldeído) para que o tecido fique totalmente submerso. Deixe o tecido em formaldeído por um mínimo de 72 h em temperatura ambiente, mudando as soluções diariamente. Armazene o tecido em um recipiente com ar apertado e realize alterações de solução sob um capô de fumaça enquanto usa EPI apropriado para evitar a propagação do vírus.
NOTA: Após o período de fixação de 72h, as amostras não precisam mais ser consideradas infecciosas. - Use uma microsserra de precisão com lâminas de diamante duplo para cortar cada espécime em três seções "grossas" para permitir uma decalcificação mais rápida do tecido. Coloque as lâminas de diamante duplo a uma distância de 5 mm, de modo que a seção central do osso temporal seja de 5 mm de espessura. Certifique-se de que as seções de tecido em cada extremidade têm 3-5 mm de espessura.
- Coloque as seções grossas em 200-300 mL de 23% c/w solução de decalcificante de ácido formômico por 7-10 dias à temperatura ambiente, até que o tecido esteja macio o suficiente para a incorporação de parafina. Mude as soluções diariamente. Verifique se há decalcificação adequada do tecido, palpando a amostra, que deve ficar macia.
NOTA: A descalcificação também pode ser verificada por raio-x. - Enxágüe os espécimes em água da torneira corrente por 24 horas, colocando-os em um grande béquer sob uma torneira em funcionamento.
- Desidratar o tecido em uma série de álcoois de concentração crescente7. Submergir o tecido em 100-200 mL de 70% de etanol por 1,5 h, seguido por três lavagens em 95% e 100% etanol para 1,5 h cada, respectivamente. Em seguida, lave o tecido 3 x 1,5 h em Xileno.
- Incorpore as seções grossas em parafina, com quatro tratamentos de 45 min cada.
- Use um criotome para cortar seções finas (10 μm). Posicione o tecido para que o tecido seja cortado no plano axial. Corte seções mais grossas (20 μm) se desejar.
3. Imunohistoquímica e imagem
- Se a tradicional coloração de hematoxilina e eosina for desejada (não descrita aqui), realize a coloração antes de montar as seções em lâminasde vidro 7.
- Monte as seções em lâminas de vidro carregadas positivamente.
- Asse os slides em uma placa quente a 60 °C por 20 minutos.
- Coloque os slides em um suporte e submerse-os em uma solução comercial de pré-tratamento contendo um solvente orgânico (diethanolamina neste caso) e etanol para desparafinar, reidratar e desmascarar o tecido.
NOTA: Este passo é necessário para alcançar resultados satisfatórios com a imunohistoquímica para tecido fixo de formalina e parafina. - Aqueça os slides em uma panela de pressão em alta pressão por 20 minutos.
- Coloque os slides em uma câmara umidificada e bloqueie o tecido com uma solução de bloqueio comercial.
- Teste as seções teciduais com o anticorpo primário contra enzima conversor de angiotensina 2 (ACE2; 1:50), transmembrana protease serina 2 (TMPRSS2, 1:1.000) e furin protease (1:250).
NOTA: Os anticorpos ACE2, TMPRSS2 e Furin são usados porque acredita-se que essas proteínas desempenham um papel na infectividade SARS-CoV-211,12, e este protocolo procurou investigar os possíveis mecanismos pelos quais o SARS-CoV-2 pode infectar o ouvido médio13. - Tratar com anticorpo secundário anti-coelho conjugado hrp (ACE2, Furin; diluição 1:100) ou anti-cabra (TMPRSS2, diluição de 1:100) anticorpo secundário.
- Contratente os slides com 70% de hematoxilina na água.
- Adquira imagens em um microscópio leve com uma câmera digital montada. Obtenha imagens da mucosa do ouvido médio e do tubo eustáquio a 20x e 10x de ampliação, respectivamente.
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Representative Results
A hematoxilina e a coloração de eosina da mucosa do ouvido médio e do tubo eustáquio mostraram preservação da mucosa do ouvido médio e do tecido médio submucosal após o processamento (Figura 1). Imagens imunohistoquímicas mostraram expressão das proteínas ACE2, TMPRSS2 e Furin dentro da mucosa do ouvido médio e do tubo eustáquio (Figura 1). A presença dessas proteínas dentro do ouvido médio fornece uma possível rota pela qual o SARS-CoV-2 pode infectar o epitélio respiratório dentro do ouvido médio 11,12,13. Além disso, a expressão dessas proteínas dentro do tubo eustáquio pode explicar uma rota pela qual o vírus entra no ouvido médio, viajando para o ouvido médio a partir da nasofaringe através do tubo eustáquio.
Figura 1: Exemplo de tecido de ouvido médio manchado. A figura mostra hematoxilina e eosina, ACE2, TMPRSS2 e mancha furin da mucosa do ouvido médio (linha superior, ampliação de 20x) e tubo eustáquio (linha inferior, ampliação de 10x). Barras de escala = 50 μm (linha superior); 100 μm (linha inferior). Abreviaturas: H&E = hematoxilina e eosina; enzima conversor de angiotensina 2; TMPRSS2 = transmembrana protease, serina 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A pesquisa óssea temporal humana é fundamental para estudar a patologia do ouvido interno e médio, mas continua sendo um esforço intensivo de tempo e recursos. Este artigo descreve uma técnica que usa uma microsserra de diamante para gerar seções ósseas temporais espessas que podem ser rapidamente descalcificadas antes de se separarem para que o tempo da colheita de tecidos para o estudo possa ser reduzido de 9-10 meses para 10-14 dias. Essa técnica pode reduzir os recursos necessários para o processamento ósseo temporal e facilitar estudos sensíveis ao tempo, como os relacionados à patologia do ouvido médio e interno13 do COVID-19, que foi a motivação para o desenvolvimento desse protocolo. Este protocolo permitiu a visualização da expressão ACE2, TMPRS22 e Furin dentro do ouvido médio e do tubo eustáquio, fornecendo um mecanismo provável pelo qual o SARS-CoV-2 pode infectar o ouvido médio espalhando-se da nasofaringe através do tubo eustáquio.
A principal inovação deste protocolo é o uso de uma serra de diamante que corta o tecido antes da decalcificação, o que gera seções "grossas" de osso temporal que podem ser rapidamente descalcificadas aumentando a área superficial do tecido exposta ao agente decalcificador. Esta etapa permite que a decalcificação tecidual ocorra dentro de 7-10 dias em vez dos 1-2 meses que os protocolos tradicionais podem exigir para a decalcificação. As seções "grossas" de tecido criadas com a serra de diamante também podem ser desidratadas mais rapidamente do que um bloco padrão de tecido ósseo temporal, reduzindo assim o tempo entre a decalcificação e a incorporação. Além disso, este protocolo utiliza a parafina como um agente de incorporação em vez de celoidina, que leva aproximadamente 3 meses para endurecer7. Enquanto a celoidina fornece preservação superior das estruturas cocleares, a parafina endurece muito mais rápido e facilita a imunostaining. Com essas modificações, o tecido ósseo temporal pode ser processado em 10-14 dias em oposição aos 9-10 meses exigidos em estratégias de processamento mais tradicionais 7,9.
Este protocolo tem várias limitações. Cortar o tecido com a serra de diamante antes de incorporar corre o risco de danificar o órgão de Corti (OOC). O OOC foi severamente danificado na maioria dos espécimes durante o desenvolvimento desta técnica, o que pode limitar o valor desta técnica para o estudo de patologias como a perda auditiva relacionada à idade, onde é vital que as estruturas delicadas do ouvido interno sejam preservadas. Pode ser possível posicionar o espécime para que a serra de diamante não corte diretamente através do osso da cápsula otica e preserve estruturas internas do ouvido, mas isso continua sendo uma área de investigação ativa. Modelos animais podem fornecer uma ferramenta valiosa para refinar ainda mais este protocolo e aumentar a chance de preservar estruturas de ouvido interno nesses valiosos espécimes humanos. A qualidade do tecido neste protocolo é adicionalmente limitada pelo uso do agente de incorporação de parafinas, que foi selecionado devido a restrições de tempo. A incorporação de celoidinas mantém melhor a integridade celular em espécimes otopatológicos, mas leva meses para endurecer7. Por último, este protocolo ainda requer tempo significativo e investimento de recursos. O uso de uma microsserra de diamante é um custo adicional aos materiais necessários para a preparação óssea temporal tradicional, e os 7-10 dias necessários para a descalcificação ainda são longos. No futuro, pode ser possível combinar esses métodos com a decalcificação assistida por micro-ondas14 para encurtar ainda mais o tempo necessário para o processamento.
Apesar de suas limitações, o protocolo para processamento ósseo temporal de alta velocidade descrito aqui oferece outra ferramenta para estudar o ouvido médio, e potencialmente o ouvido interno, patologia. Esta técnica tem sido útil durante a pandemia COVID-19 e também pode reduzir os custos associados à manutenção de um laboratório ósseo temporal ativo, reduzindo o tempo e o trabalho necessários para o processamento tecidual. A pesquisa óssea temporal diminuiu a popularidade nos Estados Unidos, diminuindo de 28 laboratórios ativos na década de 1980 para apenas 4 laboratórios ativos atualmente4. Essa queda no número de laboratórios osseis temporais operacionais pode estar relacionada aos custos significativos associados à colheita e processamento de ossos temporais 4,8. Por isso, é importante que busquemos desenvolver técnicas que reduzam os recursos necessários para o processamento ósseo temporal e também aquelas que permitem o estudo da patologia óssea temporal em novos contextos, como a pandemia COVID-19. Além disso, o processamento de tecidos de alta velocidade, como o descrito neste protocolo, pode auxiliar no uso de novas técnicas biológicas (por exemplo, imunohistoquímica, transcriômica) que permitem a avaliação da patologia do ouvido médio e interno no nível molecular 15,16,17,18,19 . Mal arranhamos a superfície em termos de utilização de técnicas moleculares para estudar tecido humano em doenças otópicas, e eles podem fornecer insights importantes que não podem ser fornecidos por modelos animais.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.
Acknowledgments
Agradecemos a Mohamed Lehar por sua ajuda com este projeto. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (T32DC0000027, NSA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet - 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
References
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