Erweiterung des Verständnisses der Tumormikroumgebung mittels massenspektrometrischer Bildgebung von formalinfixierten und paraffineingebetteten Gewebeproben
Summary
Im Zeitalter der Krebsimmuntherapie hat das Interesse an der Aufklärung der Dynamik der Tumormikroumgebung markant zugenommen. Dieses Protokoll beschreibt eine massenspektrometrische Bildgebungstechnik in Bezug auf ihre Färbe- und Bildgebungsschritte, die eine stark gemultiplexte räumliche Analyse ermöglichen.
Abstract
Fortschritte bei immunbasierten Therapien haben die Krebsbehandlung und -forschung revolutioniert. Dies hat eine wachsende Nachfrage nach der Charakterisierung der Tumorimmunlandschaft ausgelöst. Obwohl die Standard-Immunhistochemie für die Untersuchung der Gewebearchitektur geeignet ist, beschränkt sie sich auf die Analyse einer kleinen Anzahl von Markern. Umgekehrt können Techniken wie die Durchflusszytometrie mehrere Marker gleichzeitig auswerten, obwohl Informationen über die Gewebemorphologie verloren gehen. In den letzten Jahren haben sich Multiplexstrategien, die phänotypische und räumliche Analysen integrieren, als umfassende Ansätze zur Charakterisierung der Tumorimmunlandschaft herausgebildet. Hier diskutieren wir eine innovative Technologie, die metallmarkierte Antikörper und Sekundärionen-Massenspektrometrie kombiniert und sich auf die technischen Schritte in der Assay-Entwicklung und -Optimierung, Gewebevorbereitung sowie Bildaufnahme und -verarbeitung konzentriert. Vor der Färbung muss ein metallmarkiertes Antikörperpanel entwickelt und optimiert werden. Dieses Hi-Plex-Bildsystem unterstützt bis zu 40 metallmarkierte Antikörper in einem einzigen Gewebeabschnitt. Bemerkenswert ist, dass das Risiko von Signalinterferenzen mit der Anzahl der im Panel enthaltenen Marker zunimmt. Nach dem Panel-Design sollte besonders auf die Metallisotopenzuordnung zum Antikörper geachtet werden, um diese Interferenz zu minimieren. Vorläufige Paneltests werden mit einer kleinen Untergruppe von Antikörpern und anschließende Tests des gesamten Panels in Kontrollgeweben durchgeführt. Formalinfixierte, paraffineingebettete Gewebeschnitte werden gewonnen und auf goldbeschichtete Objektträger montiert und weiter gefärbt. Die Färbung dauert 2 Tage und ähnelt stark der immunhistochemischen Standardfärbung. Sobald die Proben gefärbt sind, werden sie in das Bildaufnahmegerät gelegt. Sichtfelder werden ausgewählt, Bilder werden erfasst, hochgeladen und gespeichert. Der letzte Schritt ist die Bildaufbereitung zur Filterung und Beseitigung von Störungen mit der Bildverarbeitungssoftware des Systems. Ein Nachteil dieser Plattform ist das Fehlen von Analysesoftware. Die erzeugten Bilder werden jedoch von verschiedenen Computerpathologie-Software unterstützt.
Introduction
Die Bedeutung der zahlreichen Zelltypen, die klonale Tumorpopulationen umgeben, ist ein entscheidendes Element bei der Kategorisierung der Karzinogenese. Das Interesse an der Aufklärung dieser Zusammensetzung und Wechselwirkungen der Tumormikroumgebung (TME) ist nach der Etablierung der immunbasierten Therapie als Teil des Krebsbehandlungsarsenals kontinuierlich gestiegen. Daher haben sich die Behandlungsstrategien von einem tumorzentrierten Ansatz zu einem TME-zentrierten Ansatz verlagert1.
Die Bemühungen, die Rolle von Immunzellen bei der Tumorüberwachung und Krebsentstehung aufzuklären, haben in den letzten Jahren auffallend zugenommen 2,3. In der medizinischen Forschung entstand eine Vielzahl von Methoden, darunter zytometrische Methoden und Singleplex- und Multiplex-Bildgebungstechnologien, als Teil dieses Versuchs, die einzigartigen Wechselwirkungen mehrerer Elemente von TMEs zu entschlüsseln.
Bahnbrechende Methoden wie die Durchflusszytometrie (erfunden in den 1960er Jahren), die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung und die Massenzytometrie konzentrieren sich hauptsächlich auf die Identifizierung und Quantifizierung von TME-Komponenten4. Obwohl zytometrische quantitative Techniken eine Phänotypisierung der Immunlandschaft ermöglichen, ist die Bestimmung der zellulären räumlichen Verteilung unmöglich. Umgekehrt erhalten Methoden wie die Standard-Singleplex-Immunhistochemie die Gewebearchitektur und ermöglichen es den Forschern, die zelluläre Verteilung zu analysieren, obwohl eine reduzierte Anzahl von Zielen in einem einzelnen Gewebeabschnitt eine Einschränkung dieser Methoden darstellt 5,6. In den letzten Jahren haben sich Multiplex-Bildgebungstechnologien für die Einzelzellauflösung wie Multiplex-Immunfluoreszenz, Barcoding-Fluoreszenzbildgebung und bildgebende Massenspektrometrie als umfassende Strategien zur Gewinnung von Informationen über die gleichzeitige Markerfärbung unter Verwendung desselbenGewebeabschnitts 7 herausgestellt.
Hier stellen wir eine Technologie vor, die metallmarkierte Antikörper und sekundäre Ionenmassenspektrometrie koppelt und die Quantifizierung der Einzelzellauflösung, die Marker-Coexpression (Phänotypisierung) und die räumliche Analyse unter Verwendung formalinfixierter, paraffineingebetteter (FFPE) und frisch gefrorener (FF) Gewebeproben ermöglicht 8,9. FFPE-Proben sind die am häufigsten verwendeten Materialien für die Gewebearchivierung von Proben und stellen eine leichter verfügbare Ressource für gemultiplexte Bildgebungstechnologien dar als frisch gefrorene Proben10. Darüber hinaus bietet diese Technologie die Möglichkeit, Bilder Monate später wieder aufzunehmen. Hier besprechen wir unsere Färbe- und Bildverarbeitungsprotokolle mit FFPE-Gewebeproben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die umfassende Aufklärung der komplexen, komplizierten Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Komponenten eines TME bleibt ein zentrales Ziel der Krebsforschung. Die Hersteller haben im Rahmen dieser Bemühungen zahlreiche Multiplex-Assays eingeführt, insbesondere in den letzten 5 Jahren. Die multiplexierte räumliche Analyse ist ein vielseitiges und leistungsfähiges Werkzeug, das die gleichzeitige Kategorisierung mehrerer Ziele erleichtert und gleichzeitig die strukturelle Morphologie in Tumorproben bewahrt. Rä…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Don Norwood von Editing Services, Research Medical Library bei MD Anderson für die Bearbeitung dieses Artikels und dem Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory am Department of Translational Molecular Pathology bei MD Anderson. Diese Veröffentlichung resultierte zum Teil aus der Forschung, die durch die wissenschaftliche und finanzielle Unterstützung für das Cancer Immune Monitoring and Analysis Centers-Cancer Immunologic Data Commons Network (CIMAC-CIDC) ermöglicht wurde, das durch das National Cancer Institute (NCI) Cooperative Agreement (U24CA224285) dem University of Texas MD Anderson Cancer Center Cancer Immune Monitoring and Analysis Center (CIMAC) zur Verfügung gestellt wurde.
Materials
| 100% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | |
| 95% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3404 | |
| 80% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3279 | |
| 70% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R315 | |
| 20X TBS-T | Ionpath | 567005 | |
| 10X Low-Barium PBS pH 7.4 | Ionpath | 567004 | |
| 10X Tris pH 8.5 | Ionpath | 567003 | |
| 4°C Refrigerator | ThermoScientific | REVCO | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P10 | Olympus | 24-401 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P20 | Olympus | 24-404 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P200 | Olympus | 24-412 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P1000 | Olympus | 24-430 | |
| Centrifugal Filter Ultrafree-MC | Fisher Scientific | UFC30VV00 | |
| Deionized H2O | Ionpath | 567002 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Green | Electron Microscopy Sciences | 71385-G | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Yellow | Electron Microscopy Sciences | 71385-Y | |
| EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White | Electron Microscopy Sciences | 71388-01 | |
| EasyDip Stainless Steel Holder | Electron Microscopy Sciences | 71388-50 | |
| Glutaraldehyde 70% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 16360 | |
| Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9 | Dako | S2367 | |
| Heat resistant slide chamber | Electron Microscopy Sciences | 62705-01 | |
| Hydrophobic barrier pen | Fisher | 50-550-221 | |
| MIBI/O software | Ionpath | NA | |
| MIBIcontrol software | Ionpath | NA | |
| MIBIslide | Ionpath | 567001 | |
| MIBIscope | Ionpath | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Moisture Chamber (Humid Chamber) | Simport | M922-1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets | Fisher Scientific | BP2944100 | |
| PT Module | Thermo Scientific | A80400012 | |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units | Fisher Scientific | 097403A | |
| Shaker | BioRocker | S2025 | |
| Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm ) | MillQ | UFC30VV00 | |
| Slide oven | Fisher Scientific | 6901 | |
| Vaccum Cabinet Desiccator | VWR | 30621-076 | |
| Task-whipe | Kimberly Clark | 34155 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
Riferimenti
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