JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingegneria

В пробирке Восстановление актин-цитоскелета внутри гигантских одноцветных везикул

Published: August 25, 2022
doi:
10.3791/64026
, ,
1Department of Biomedical Engineering,Yale University, 2Systems Biology Institute,Yale University, 3Department of Physics,Yale University

Summary

В этой рукописи мы демонстрируем экспериментальные методы инкапсулирования F-актинового цитоскелета в гигантские одноламеллярные липидные везикулы (также называемые липосомами) и метод формирования биомимикирующего коры F-актинового слоя на внутреннем листке липосомной мембраны.

Abstract

Актиновый цитоскелет, главный механический механизм в клетке, опосредует многочисленные важные физические клеточные действия, включая клеточную деформацию, деление, миграцию и адгезию. Однако изучение динамики и структуры актиновой сети in vivo осложняется биохимической и генетической регуляцией внутри живых клеток. Чтобы построить минимальную модель, лишенную внутриклеточной биохимической регуляции, актин инкапсулируется внутри гигантских одноламеллярных везикул (ГУВ, также называемых липосомами). Биомиметические липосомы имеют размер клетки и облегчают количественное понимание механических и динамических свойств сети цитоскелетов, открывая жизнеспособный путь для синтетической биологии снизу вверх. Для получения липосом для инкапсуляции используется метод инвертированной эмульсии (также называемый методом переноса эмульсии), который является одним из наиболее успешных методов инкапсуляции сложных растворов в липосомы для подготовки различных систем, имитирующих клетки. С помощью этого способа во внутренний буфер добавляют интересующую смесь белков, которую позже эмульгируют в фосфолипидсодержащем растворе минерального масла с образованием монослойных липидных капель. Желаемые липосомы образуются из монослойных липидных капель, пересекающих липидно-масляно-водный интерфейс. Этот метод позволяет инкапсуляцию концентрированных актиновых полимеров в липосомы с желаемыми липидными компонентами, прокладывая путь для восстановления in vitro биомикирующей цитоскелетной сети.

Introduction

Актиновый цитоскелет играет фундаментальную роль в построении внутриклеточной архитектуры клетки путем координации сократимости на молекулярном уровне и генерации силы 1,2,3. В результате он опосредует многочисленные важные клеточные активности, включая клеточную деформацию 4,5, деление6, миграцию 7,8 и адгезию9. Восстановление актиновых сетей in vitro привлекло огромное внимание в последние годы 10,11,12,13,14,15,16,17. Целью восстановления является построение минимальной модели клетки, лишенной сложной биохимической регуляции, которая существует в живых клетках. Это обеспечивает контролируемую среду для зондирования специфических внутриклеточных действий и облегчает идентификацию и анализ различных компонентов актинового цитоскелета18,19. Кроме того, инкапсуляция актиновых сетей in vitro внутри фосфолипидных гигантских одноламеллярных везикул (ГУВ, липосом) обеспечивает ограниченное, но деформируемое пространство с полупроницаемой границей. Он имитирует физиологическое и механическое микроокружение актинового механизма в клетке 9,20,21,22.

Среди различных методов получения липосом метод гидратации липидной пленки (также известный как метод набухания) является одним из самых ранних методов23. Сухая липидная пленка увлажняется с добавлением буферов, образуя мембранозные пузырьки, которые в конечном итоге становятся везикулами24. Чтобы получить более крупные везикулы с более высоким выходом, улучшенный метод, продвигающийся от метода гидратации пленки, известный как методэлектроформации 25, применяет электрическое поле переменного тока для эффективного содействия процессугидратации 26. Основные ограничения этих основанных на гидратации методов инкапсуляции актина заключаются в том, что они имеют низкую эффективность инкапсуляции высококонцентрированных белков и совместимы только со специфическими липидными композициями24. Метод инвертированной эмульсии, для сравнения, имеет меньше ограничений для липидных компонентов и концентраций белка 20,27,28,29. В этом способе смесь белков для инкапсуляции добавляют во внутренний водный буфер, который впоследствии эмульгируют в растворе липидсодержащего минерального масла, образуя липидно-монослойные капли. Монослойные липидные капли затем пересекают другую границу раздела липид/масло-вода посредством центрифугирования с образованием двухслойных липидных везикул (липосом). Этот метод оказался одной из самых успешных стратегий инкапсуляции актина 24,30. Отдельно выделяют некоторые методы микрофлюидных устройств, включая импульсную струйнуюобработку 31,32, переходный мембранный выброс33 и метод34 cDICE. Сходство между методом инвертированной эмульсии и микрофлюидным способом заключается в использовании липидного растворителя (масла) и введении интерфейса липид/масло-вода для образования внешнего листочка липосом. Напротив, генерация липосом микрофлюидным методом требует установки микрофлюидных устройств и сопровождается попаданием масла между двумя листочками бислоя, что требует дополнительного шага для удаления масла35.

В этой рукописи мы использовали метод инвертированной эмульсии для получения липосом, инкапсулирующих полимеризованную F-актиновую сеть, как это использовалось ранее22. Белковую смесь для инкапсуляции сначала помещали в буфер с неполимеризующими условиями для поддержания актина в его глобулярной (G) форме. Весь процесс проводили при 4 °C, чтобы предотвратить раннюю полимеризацию актина, которая позже была вызвана тем, что образец нагревался до комнатной температуры. После комнатной температуры актин полимеризуется в нитевидную (F) форму. Различные актин-связывающие белки могут быть добавлены во внутренний водный буферный раствор для изучения функциональных возможностей и свойств белка, таким образом, дополнительно давая представление о его взаимодействии с актиновой сетью и поверхностью мембраны. Этот метод также может быть применен для инкапсуляции различных белков, представляющих интерес36, и крупных объектов (микрочастиц, самоходных микропловцев и т.д.), близких к размеру конечных липосом28,37.

Protocol

1. Приготовление буферов и белковых растворов Готовят водный буфер внутренней неполимеризации (INP) в общем объеме 5 мл путем смешивания 0,1 мМCaCl2, 10 мМ HEPES (рН 7,5), 1 мМ DTT, 0,5 мМ Dabco, 320 мМ сахарозы и 0,2 мМ АТФ. Приготовьте белковую смесь (PM), добавив белки в буфер INP при 4 °C с…

Representative Results

Получение липосом на основе метода инвертированной эмульсии проиллюстрировано графически и схематично на фиг.1. Во-первых, были получены пустые (голые) липосомы (~5-50 мкм в диаметре), которые состояли из фосфолипида (EPC) и флуоресцентного липида (DHPE). Яркий, д?…

Discussion

Несколько ключевых шагов определяют успешность высокого выхода липосом в процессе приготовления. Чтобы полностью растворить липидную пленку в масле, образец необходимо обрабатывать ультразвуком до тех пор, пока липидная пленка на дне стеклянного флакона полностью не исчезнет. После …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы признаем финансирование ARO MURI W911NF-14-1-0403 для M.P.M., Национальных институтов здравоохранения (NIH) R01 1R01GM126256 для M.P.M., Национальных институтов здравоохранения (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 и Human Frontiers Science Program (HFSP) номер гранта RGY0073/2018 для M.P.M. Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этом материале, принадлежат авторам (авторам) и не обязательно отражают взгляды ARO, NIH или HFSP. С.К. отмечает плодотворные беседы с В. Ядавом, К. Муресаном, С. Амири.

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)  Avanti Polar Lipids Inc. 231615773 Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane Sigma D27802-25G DABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AKL99-D non-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AR05 fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma A2383-10G ATP
Alexa Fluor 647 dye ThermoFisher fluorescent dye
Andor iQ3 Andor Technologies control and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain Cytoskeleton, Inc RP01P-A Arp 2/3
Calcium chloride dihydrate Sigma 10035048 CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip) Quorum Technologies incubation chamber
Cofilin protein: human recombinant Cytoskeleton, Inc CF01-C cofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective) Andor Technologies LEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA Sigma G7528 glucose
Dithiothreitol DOT Scientific  DSD11000-10 DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant Cytoskeleton, Inc HPG6 gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tip Cole-Parmer UX-07940-53 glass syringe
HEPES AmericanBio 7365-45-9
ImageJ/Fiji https://imagej.net/tutorials/
L-alpha-Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids Inc. 97281442 EPC
Magnesium chloride Sigma 7786303 MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil Sigma 8042475 mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His) VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE) Thermo Fisher O12650 DHPE
Potassium chloride Sigma 7447407 KCl
Sucrose Sigma 57-50-1 sucrose
β-Casein from bovine milk Sigma C6905-250MG
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Murrell, M., Oakes, P. W., Lenz, M., Gardel, M. L. Forcing cells into shape: the mechanics of actomyosin contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 486-498 (2015).
  2. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  3. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  4. Yousafzai, M., Yadav, V., Amiri, S., Errami, Y., Murrell, M. Active regulation of pressure and volume defines an energetic constraint on the size of cell aggregates. Physical Review Letters. 128 (4), 048103 (2022).
  5. Simon, C., et al. Actin dynamics drive cell-like membrane deformation. Nature Physics. 15 (6), 602-609 (2019).
  6. Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Developmental Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
  7. Bray, D., White, J. Cortical flow in animal cells. Science. 239 (4842), 883-888 (1988).
  8. Beaune, G., et al. Spontaneous migration of cellular aggregates from giant keratocytes to running spheroids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12926-12931 (2018).
  9. Murrell, M. P., et al. Liposome adhesion generates traction stress. Nature Physics. 10 (2), 163-169 (2014).
  10. Lee, G., et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), (2021).
  11. Anderson, S., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).
  12. Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
  13. McCall, P. M., MacKintosh, F. C., Kovar, D. R., Gardel, M. L. Cofilin drives rapid turnover and fluidization of entangled F-actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12629-12637 (2019).
  14. Köhler, S., Schaller, V., Bausch, A. R. Structure formation in active networks. Nature Materials. 10 (6), 462-468 (2011).
  15. Koenderink, G. H., et al. An active biopolymer network controlled by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15192-15197 (2009).
  16. Seara, D. S., et al. Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin. Nature Communications. 9 (1), 1-10 (2018).
  17. Tabatabai, A. P., et al. Detailed balance broken by catch bond kinetics enables mechanical-adaptation in active materials. Advanced Functional Materials. 31 (10), 2006745 (2021).
  18. Murrell, M. P., Gardel, M. L. F-actin buckling coordinates contractility and severing in a biomimetic actomyosin cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 20820-20825 (2012).
  19. Murrell, M., Gardel, M. L. Actomyosin sliding is attenuated in contractile biomimetic cortices. Molecular Biology of the Cell. 25 (12), 1845-1853 (2014).
  20. Murrell, M., et al. Spreading dynamics of biomimetic actin cortices. Biophysical Journal. 100 (6), 1400-1409 (2011).
  21. Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nature Physics. 4 (10), 789-793 (2008).
  22. Pontani, L. -. L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
  23. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  24. Litschel, T., Schwille, P. Protein reconstitution inside giant unilamellar vesicles. Annual Review of Biophysics. 50, 525-548 (2021).
  25. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  26. Limozin, L., Sackmann, E. Polymorphism of cross-linked actin networks in giant vesicles. Physical Review Letters. 89 (16), 168103 (2002).
  27. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  28. Natsume, Y., et al. Preparation of giant vesicles encapsulating microspheres by centrifugation of a water-in-oil emulsion. Journal of Visualized Experiments. (119), e55282 (2017).
  29. Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, I. s. Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophysical Journal. 107 (2), 346-354 (2014).
  30. Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578-1591 (2014).
  31. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesiclelike compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. Journal of the American Chemical Society. 129 (42), 12608-12609 (2007).
  32. Okushima, S., Nisisako, T., Torii, T., Higuchi, T. Controlled production of monodisperse double emulsions by two-step droplet breakup in microfluidic devices. Langmuir. 20 (23), 9905-9908 (2004).
  33. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  34. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
  35. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  36. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  37. Vutukuri, H. R., et al. Active particles induce large shape deformations in giant lipid vesicles. Nature. 586 (7827), 52-56 (2020).
  38. Lemière, J., Carvalho, K., Sykes, C. . Methods in Cell Biology. 128, 271-285 (2015).
  39. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  40. Liman, J., et al. The role of the Arp2/3 complex in shaping the dynamics and structures of branched actomyosin networks. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (20), 10825-10831 (2020).
  41. Sun, Y., Leong, N. T., Wong, T., Drubin, D. G. A Pan1/End3/Sla1 complex links Arp2/3-mediated actin assembly to sites of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 26 (21), 3841-3856 (2015).
  42. Bretschneider, T., et al. Dynamic actin patterns and Arp2/3 assembly at the substrate-attached surface of motile cells. Current Biology. 14 (1), 1-10 (2004).
  43. Goley, E. D., et al. An actin-filament-binding interface on the Arp2/3 complex is critical for nucleation and branch stability. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 107 (18), 8159-8164 (2010).
  44. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia. The Journal of Cell Biology. 145 (5), 1009-1026 (1999).
  45. Kelleher, J. F., Atkinson, S. J., Pollard, T. D. Sequences, structural models, and cellular localization of the actin-related proteins Arp2 and Arp3 from Acanthamoeba. The Journal of Cell Biology. 131 (2), 385-397 (1995).
  46. Prehoda, K. E., Scott, J. A., Mullins, R. D., Lim, W. A. Integration of multiple signals through cooperative regulation of the N-WASP-Arp2/3 complex. Science. 290 (5492), 801-806 (2000).
  47. Delatour, V., et al. Arp2/3 controls the motile behavior of N-WASP-functionalized GUVs and modulates N-WASP surface distribution by mediating transient links with actin filaments. Biophysical Journal. 94 (12), 4890-4905 (2008).
  48. Izdebska, M., Zielińska, W., Hałas-Wiśniewska, M., Grzanka, A. Involvement of actin and actin-binding proteins in carcinogenesis. Cells. 9 (10), 2245 (2020).
  49. Schäfer, E., Kliesch, T. -. T., Janshoff, A. Mechanical properties of giant liposomes compressed between two parallel plates: impact of artificial actin shells. Langmuir. 29 (33), 10463-10474 (2013).
  50. Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
  51. Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
  52. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  53. Vale, R. . Reconstituting the Cytoskeleton. , (2014).
  54. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Mechanism of K+-induced actin assembly. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 648-654 (1982).
  55. Zimmerle, C. T., Frieden, C. Effect of pH on the mechanism of actin polymerization. Biochimica. 27 (20), 7766-7772 (1988).
  56. Wegner, A. M., et al. N-wasp and the arp2/3 complex are critical regulators of actin in the development of dendritic spines and synapses. Journal of Biological Chemistry. 283 (23), 15912-15920 (2008).
  57. Blanchoin, L., et al. Direct observation of dendritic actin filament networks nucleated by Arp2/3 complex and WASP/Scar proteins. Nature. 404 (6781), 1007-1011 (2000).
  58. Römer, W., et al. Actin dynamics drive membrane reorganization and scission in clathrin-independent endocytosis. Cell. 140 (4), 540-553 (2010).
  59. Popova, A. V., Hincha, D. K. Effects of flavonol glycosides on liposome stability during freezing and drying. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1858 (12), 3050-3060 (2016).
  60. Harrigan, P., Madden, T., Cullis, P. Protection of liposomes during dehydration or freezing. Chemistry and Physics of Lipids. 52 (2), 139-149 (1990).
  61. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9 (1), 467-508 (1980).
  62. Campillo, C., et al. Unexpected membrane dynamics unveiled by membrane nanotube extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
  63. Deng, N. -. N., Yelleswarapu, M., Huck, W. T. Monodisperse uni-and multicompartment liposomes. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7584-7591 (2016).
  64. Ricketts, S. N., Ross, J. L., Robertson-Anderson, R. M. Co-entangled actin-microtubule composites exhibit tunable stiffness and power-law stress relaxation. Biophysical journal. 115 (6), 1055-1067 (2018).
  65. Sheung, J. Y., et al. Motor-driven restructuring of cytoskeleton composites leads to tunable time-varying elasticity. ACS Macro Letters. 10 (9), 1151-1158 (2021).
  66. Falzone, T. T., Blair, S., Robertson-Anderson, R. M. Entangled F-actin displays a unique crossover to microscale nonlinearity dominated by entanglement segment dynamics. Soft Matter. 11 (22), 4418-4423 (2015).
  67. Francis, M. L., et al. Non-monotonic dependence of stiffness on actin crosslinking in cytoskeleton composites. Soft Matter. 15 (44), 9056-9065 (2019).
  68. Yadav, V., et al. Filament nucleation tunes mechanical memory in active polymer networks. Advanced Functional Materials. 29 (49), 1905243 (2019).
  69. Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. . Methods in Enzymology. 540, 265-282 (2014).

Tags

Actin CytoskeletonIn Vitro ReconstitutionGiant Unilamellar VesiclesLiposome YieldEncapsulation EfficiencyProtein EncapsulationMicroparticle EncapsulationSelf-propelling MicroswimmersNon-polymerization BufferPolymerization BufferEGGPCNickel Lipid
check_url/it/64026?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (186), e64026, doi:10.3791/64026 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image