In dit manuscript demonstreren we de experimentele technieken om het F-actinecytoskelet in te kapselen in gigantische unilamellaire lipideblaasjes (ook wel liposomen genoemd), en de methode om een cortex-biomimicking F-actinelaag te vormen aan de binnenste folder van het liposoommembraan.
Het actinecytoskelet, de belangrijkste mechanische machinerie in de cel, bemiddelt tal van essentiële fysieke cellulaire activiteiten, waaronder celvervorming, deling, migratie en adhesie. Het bestuderen van de dynamiek en structuur van het actinenetwerk in vivo wordt echter bemoeilijkt door de biochemische en genetische regulatie in levende cellen. Om een minimaal model te bouwen zonder intracellulaire biochemische regulatie, wordt actine ingekapseld in gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs, ook wel liposomen genoemd). De biomimetische liposomen zijn celgroot en vergemakkelijken een kwantitatief inzicht in de mechanische en dynamische eigenschappen van het cytoskeletnetwerk, waardoor een levensvatbare route wordt geopend voor bottom-up synthetische biologie. Om liposomen voor inkapseling te genereren, wordt de omgekeerde emulsiemethode (ook wel de emulsieoverdrachtsmethode genoemd) gebruikt, wat een van de meest succesvolle technieken is voor het inkapselen van complexe oplossingen in liposomen om verschillende celnabootsingssystemen voor te bereiden. Met deze methode wordt een mengsel van interessante eiwitten toegevoegd aan de binnenbuffer, die later wordt geëmulgeerd in een fosfolipide-bevattende minerale olieoplossing om monolaagse lipidedruppeltjes te vormen. De gewenste liposomen worden gegenereerd uit monolaagse lipidedruppels die een lipide / olie-water-interface kruisen. Deze methode maakt de inkapseling van geconcentreerde actinepolymeren in de liposomen met gewenste lipidecomponenten mogelijk, waardoor de weg wordt vrijgemaakt voor in vitro reconstitutie van een biomimicking cytoskeletnetwerk.
Het actinecytoskelet speelt een fundamentele rol bij het construeren van de intracellulaire architectuur van de cel door contractiliteit op moleculair niveau en krachtgeneratie 1,2,3 te coördineren. Als gevolg hiervan bemiddelt het tal van essentiële cellulaire activiteiten, waaronder celvervorming 4,5, deling6, migratie 7,8 en adhesie9. De in vitro reconstitutie van actinenetwerken heeft de afgelopen jaren enorme aandacht gekregen 10,11,12,13,14,15,16,17. Het doel van reconstitutie is om een minimaal model van de cel te bouwen zonder de complexe biochemische regulatie die bestaat in levende cellen. Dit biedt een controleerbare omgeving om specifieke intracellulaire activiteiten te onderzoeken en vergemakkelijkt de identificatie en analyse van verschillende componenten van het actinecytoskelet 18,19. Verder biedt de inkapseling van in vitro actinenetwerken in fosfolipide gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs, liposomen) een beperkte maar vervormbare ruimte met een semi-permeabele grens. Het bootst de fysiologische en mechanische micro-omgeving van de actinemachinerie na in de cel 9,20,21,22.
Onder verschillende methoden om liposomen te bereiden, is de lipidefilmhydratatiemethode (ook bekend als de zwellingsmethode) een van de vroegste technieken23. De droge lipidefilm hydrateert met de toevoeging van buffers en vormt vliezige bubbels die uiteindelijk blaasjes worden24. Om grotere blaasjes met een hogere opbrengst te produceren, past een verbeterde methode die voortgaat op de filmhydratatiemethode, bekend als de elektroformatiemethode25, een AC elektrisch veld toe om het hydratatieproces efficiënt te bevorderen26. De belangrijkste beperkingen van deze op hydratatie gebaseerde methoden voor actine-inkapseling zijn dat het een lage inkapselingsefficiëntie van sterk geconcentreerde eiwitten heeft en alleen compatibel is met specifieke lipidesamenstellingen24. De omgekeerde emulsietechniek heeft in vergelijking minder beperkingen voor lipidecomponenten en eiwitconcentraties 20,27,28,29. Bij deze methode wordt een mengsel van eiwitten voor inkapseling toegevoegd aan de binnenste waterige buffer, die later wordt geëmulgeerd in een lipidebevattende minerale olieoplossing, waarbij lipide-monolaagdruppeltjes worden gevormd. De monolaagse lipidedruppels kruisen vervolgens door een andere lipide / olie-water-interface door centrifugatie om bilayer lipide blaasjes (liposomen) te vormen. Deze techniek is een van de meest succesvolle strategieën gebleken voor actine-inkapseling24,30. Afzonderlijk zijn er enkele microfluïdische apparaatmethoden, waaronder gepulseerde jetting31,32, transiënte membraanuitwerping33 en de cDICE-methode34. De overeenkomsten tussen de omgekeerde emulsiemethode en de microfluïdische methode zijn het lipideoplosmiddel (olie) dat wordt gebruikt en de introductie van lipide / olie-water-interface voor de vorming van de buitenste folder van liposomen. Daarentegen vereist het genereren van liposomen door de microfluïdische methode een opstelling van microfluïdische apparaten en gaat gepaard met olie die tussen de twee blaadjes van de bilayer is opgesloten, wat een extra stap vereist voor olieverwijdering35.
In dit manuscript gebruikten we de omgekeerde emulsietechniek om liposomen te bereiden die een gepolymeriseerd F-actinenetwerk inkapselen zoals eerder gebruikt22. Het eiwitmengsel voor inkapseling werd eerst in een buffer met niet-polymeriserende omstandigheden geplaatst om actine in zijn bolvormige (G) vorm te behouden. Het hele proces werd uitgevoerd bij 4 °C om vroege actinepolymerisatie te voorkomen, die later werd geactiveerd door het monster te laten opwarmen tot kamertemperatuur. Eenmaal op kamertemperatuur polymeriseert de actine in zijn filamenteuze (F) vorm. Een verscheidenheid aan actinebindende eiwitten kan worden toegevoegd aan de binnenste waterige bufferoplossing om eiwitfunctionaliteiten en -eigenschappen te bestuderen, waardoor verdere inzichten worden verkregen in de interactie met het actinenetwerk en het membraanoppervlak. Deze methode kan ook worden toegepast op de inkapseling van verschillende eiwitten van belang36 en grote objecten (microdeeltjes, zelfrijdende microswimmers, enz.) dicht bij de grootte van de uiteindelijke liposomen28,37.
Verschillende belangrijke stappen bepalen het succes van een hoge opbrengst van liposomen tijdens het bereidingsproces. Om de lipidefilm in de olie volledig op te lossen, moet het monster worden gesoniseerd totdat de lipidefilm op de bodem van de glazen injectieflacon volledig verdwijnt. Na de ultrasoonapparaat moet het lipide-oliemengsel ‘s nachts bij kamertemperatuur onder donkere omstandigheden worden bewaard om de lipidemoleculen verder te laten dispergeren29. Het mengsel kan maximaal een week…
The authors have nothing to disclose.
We erkennen de financiering van ARO MURI W911NF-14-1-0403 aan M.P.M., de National Institutes of Health (NIH) R01 1R01GM126256 aan M.P.M., de National Institutes of Health (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 en Human Frontiers Science Program (HFSP) subsidienummer RGY0073/2018 aan M.P.M. Alle meningen, bevindingen, conclusies of aanbevelingen die in dit materiaal worden uitgedrukt, zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de ARO, NIH of HFSP. S.C. erkent vruchtbare gesprekken met V. Yadav, C. Muresan en S. Amiri.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni) | Avanti Polar Lipids Inc. | 231615773 | Nickel Lipid |
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane | Sigma | D27802-25G | DABCO |
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton, Inc | AKL99-D | non-fluorescent G-actin |
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton, Inc | AR05 | fluorescently labeled actin |
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383-10G | ATP |
Alexa Fluor 647 dye | ThermoFisher | fluorescent dye | |
Andor iQ3 | Andor Technologies | control and acquisition software for confocal microscope | |
Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain | Cytoskeleton, Inc | RP01P-A | Arp 2/3 |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 10035048 | CaCl2 |
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip) | Quorum Technologies | incubation chamber | |
Cofilin protein: human recombinant | Cytoskeleton, Inc | CF01-C | cofilin |
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective) | Andor Technologies | LEICA DMi8 | |
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA | Sigma | G7528 | glucose |
Dithiothreitol | DOT Scientific | DSD11000-10 | DTT |
Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant | Cytoskeleton, Inc | HPG6 | gelsolin |
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tip | Cole-Parmer | UX-07940-53 | glass syringe |
HEPES | AmericanBio | 7365-45-9 | |
ImageJ/Fiji | https://imagej.net/tutorials/ | ||
L-alpha-Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids Inc. | 97281442 | EPC |
Magnesium chloride | Sigma | 7786303 | MgCl2 |
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil | Sigma | 8042475 | mineral oil |
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His) | VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests | ||
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE) | Thermo Fisher | O12650 | DHPE |
Potassium chloride | Sigma | 7447407 | KCl |
Sucrose | Sigma | 57-50-1 | sucrose |
β-Casein from bovine milk | Sigma | C6905-250MG |