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Bioingegneria

체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

Published: August 25, 2022
doi:
10.3791/64026
, ,
1Department of Biomedical Engineering,Yale University, 2Systems Biology Institute,Yale University, 3Department of Physics,Yale University

Summary

이 원고에서는 F-actin 세포 골격을 거대한 unilamellar 지질 소포 (리포솜이라고도 함)로 캡슐화하는 실험 기술과 리포솜 막의 내부 전단지에 피질 생모방 F- 액틴 층을 형성하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

세포의 주요 기계 기계 인 액틴 세포 골격은 세포 변형, 분열, 이동 및 부착을 포함한 수많은 필수적인 물리적 세포 활동을 매개합니다. 그러나, 생체내에서 액틴 네트워크의 역학 및 구조를 연구하는 것은 살아있는 세포 내의 생화학적 및 유전적 조절에 의해 복잡하다. 세포 내 생화학 적 조절이없는 최소한의 모델을 구축하기 위해 액틴은 거대한 unilamellar vesicles (GUV, 리포솜이라고도 함) 내부에 캡슐화됩니다. 생체모방 리포솜은 세포 크기이며 세포 골격 네트워크의 기계적 및 동적 특성에 대한 정량적 통찰력을 촉진하여 상향식 합성 생물학을위한 실행 가능한 경로를 열어줍니다. 캡슐화를 위해 리포솜을 생성하기 위해 역전 에멀젼 방법 (에멀젼 전달 방법이라고도 함)이 사용되며, 이는 복잡한 용액을 리포솜으로 캡슐화하여 다양한 세포 모방 시스템을 제조하는 가장 성공적인 기술 중 하나입니다. 이 방법으로, 관심있는 단백질의 혼합물이 내부 완충액에 첨가되고, 이는 나중에 인지질 함유 광유 용액에서 유화되어 단층 지질 방울을 형성한다. 원하는 리포솜은 지질/오일-물 계면을 가로지르는 단층 지질 방울로부터 생성된다. 이 방법은 농축된 액틴 중합체를 원하는 지질 성분을 갖는 리포솜 내로 캡슐화할 수 있게 하여, 생체모방 세포골격 네트워크의 시험관내 재구성을 위한 길을 닦아준다.

Introduction

액틴 세포골격은 분자 수준의 수축성 및 힘 생성 1,2,3을 조정함으로써 세포의 세포내 구조를 구성하는데 근본적인 역할을 한다. 그 결과, 세포 변형4,5, 분열6, 이동 7,8 및 부착9를 포함하는 수많은 필수 세포 활동을 매개한다. 액틴 네트워크의 시험관내 재구성은 최근 몇 년 동안10,11,12,13,14,15,16,17에서 엄청난 주목을 받았다. 재구성의 목표는 살아있는 세포 내에 존재하는 복잡한 생화학 적 조절이없는 세포의 최소 모델을 구축하는 것입니다. 이는 특정 세포내 활동을 조사하기 위한 조절가능한 환경을 제공하고, 액틴 세포골격(18,19)의 상이한 성분들의 확인 및 분석을 용이하게 한다. 또한, 인지질 거대 유니라멜라 소포(GUVs, 리포솜) 내부의 시험관내 액틴 네트워크의 캡슐화는 반투과성 경계를 갖는 한정된 그러나 변형가능한 공간을 제공한다. 그것은 세포 내 액틴 기계의 생리적, 기계적 미세 환경 9,20,21,22을 모방합니다.

리포솜을 제조하는 다양한 방법 중에서, 지질막 수화 방법(팽윤 방법이라고도 함)은 가장 초기의 기술(23) 중 하나이다. 건조 지질 필름은 완충제를 첨가하여 수화되어 막강한 기포를 형성하여 결국 소포(24)가됩니다. 더 높은 수율로 더 큰 소포를 생산하기 위해, 전기 형성 방법(25)으로 알려진 필름 수화 방법으로부터 발전하는 개선된 방법은 AC 전기장을 적용하여 수화 공정(26)을 효율적으로 촉진시킨다. 액틴 캡슐화를 위한 이러한 수화-기반 방법의 주요 한계는 고농축 단백질의 낮은 캡슐화 효율을 가지며, 단지 특정 지질 조성물(24)과 양립가능하다는 것이다. 이에 비해 반전된 에멀젼 기술은 지질 성분 및 단백질 농도 20,27,28,29에 대한 제한이 적습니다. 이 방법에서, 캡슐화를 위한 단백질의 혼합물이 내부 수성 완충액에 첨가되고, 이는 나중에 지질 함유 광유 용액에서 유화되어, 지질-단층 액적을 형성한다. 단층 지질 방울은 원심분리를 통해 다른 지질 / 오일 – 물 계면을 통과하여 이중층 지질 소포 (리포솜)를 형성합니다. 이 기술은 액틴 캡슐화24,30에 대한 가장 성공적인 전략 중 하나임이 입증되었습니다. 별개로, 펄스 분사(31,32), 과도 막 토출(33), 및 cDICE 방법(34)을 포함하는 일부 미세유체 장치 방법이 있다. 반전 에멀젼 방법과 미세 유체 방법 사이의 유사점은 사용되는 지질 용매 (오일)와 리포솜의 외부 전단지의 형성을위한 지질 / 오일 – 물 계면의 도입입니다. 대조적으로, 미세유체 방법에 의한 리포솜의 생성은 미세유체 장치의 셋업을 필요로 하고, 이중층의 두 전단지 사이에 포획된 오일을 수반하며, 이는 오일 제거(35)를 위한 추가적인 단계를 필요로 한다.

이 원고에서, 우리는 이전에22에서 사용했던 바와 같이 중합된 F-액틴 네트워크를 캡슐화하는 리포솜을 제조하기 위해 반전된 에멀젼 기술을 사용했다. 캡슐화를 위한 단백질 혼합물을 먼저 액틴을 그의 구상(G) 형태로 유지하기 위해 비중합 조건의 완충액에 넣었다. 전체 공정은 초기 액틴 중합을 방지하기 위해 4°C에서 수행되었고, 이는 나중에 샘플을 실온으로 가온하도록 허용함으로써 촉발되었다. 일단 실온에서 일단 액틴은 그의 필라멘트성 (F) 형태로 중합된다. 다양한 액틴 결합 단백질을 내부 수성 완충 용액에 첨가하여 단백질 기능 및 특성을 연구 할 수 있으므로 액틴 네트워크 및 막 표면과의 상호 작용에 대한 통찰력을 추가로 제공합니다. 이 방법은 또한 최종 리포솜(28,37)의 크기에 가까운 다양한 목적 단백질(36) 및 대형 물체(미세입자, 자기 추진식 마이크로수영 등)의 캡슐화에도 적용될 수 있다.

Protocol

1. 완충액 및 단백질 용액의 제조 0.1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM DTT, 0.5 mM 다브코,320 mM 수크로오스 및 0.2 mM ATP를 혼합하여 총 부피 5 mL의 수성 내부 비중합 (INP) 완충액을 제조하였다. 단백질을 다음 농도로 4°C에서 INP 버퍼에 첨가하여 단백질 믹스(PM)를 제조하였다: 11.2 μM 비형광 G-액틴, 2.8 μM 형광 표지된 액틴, 및 0.24 μM Arp2/3 (표 of Materials). F-액틴 ?…

Representative Results

반전된 에멀젼 기술에 기초한 리포좀의 제조는 도 1에 그래픽으로 그리고 개략적으로 도시되어 있다. 먼저, 비어있는(bare) 리포좀(직경 5-50 μm)을 인지질(EPC)과 형광 지질(DHPE)로 구성하여 제조하였다. 밝고 먼 적색 형광 염료를 대조군 실험으로서 베어 리포좀 내에 캡슐화하였다. 지질 단일층이 액적의 주변에서 성공적으로 형성되었는지 여부는 <strong clas…

Discussion

몇 가지 주요 단계는 준비 과정 동안 리포솜의 높은 수율의 성공을 결정합니다. 오일에 지질 필름을 완전히 용해시키기 위해서는 유리 바이알 바닥의 지질 막이 완전히 사라질 때까지 샘플을 초음파 처리해야합니다. 초음파 처리 후, 지질-오일 혼합물은 지질 분자가 추가로 분산되기 위해 어두운 조건 하에서 실온에서 밤새 저장되어야 한다(29). 혼합물은 최대 일주일 동안 4°C에?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 ARO MURI W911NF-14-1-0403을 M.P.M., 국립 보건원 (NIH) R01 1R01GM126256에서 M.P.M., 국립 보건원 (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, 미시간 대학 / 제넨테크, SUBK00016255 및 인간 국경 과학 프로그램 (HFSP) 보조금 번호 RGY0073 / 2018을 M.P.M.에 지원하는 것을 인정합니다. 이 자료에 표현 된 의견, 결과, 결론 또는 권장 사항은 저자의 의견이며 ARO, NIF 또는 HFSP의 견해를 반드시 반영하지는 않습니다. S.C.는 V. Yadav, C. Muresan, S. Amiri와의 유익한 토론을 인정합니다.

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)  Avanti Polar Lipids Inc. 231615773 Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane Sigma D27802-25G DABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AKL99-D non-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AR05 fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma A2383-10G ATP
Alexa Fluor 647 dye ThermoFisher fluorescent dye
Andor iQ3 Andor Technologies control and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain Cytoskeleton, Inc RP01P-A Arp 2/3
Calcium chloride dihydrate Sigma 10035048 CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip) Quorum Technologies incubation chamber
Cofilin protein: human recombinant Cytoskeleton, Inc CF01-C cofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective) Andor Technologies LEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA Sigma G7528 glucose
Dithiothreitol DOT Scientific  DSD11000-10 DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant Cytoskeleton, Inc HPG6 gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tip Cole-Parmer UX-07940-53 glass syringe
HEPES AmericanBio 7365-45-9
ImageJ/Fiji https://imagej.net/tutorials/
L-alpha-Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids Inc. 97281442 EPC
Magnesium chloride Sigma 7786303 MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil Sigma 8042475 mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His) VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE) Thermo Fisher O12650 DHPE
Potassium chloride Sigma 7447407 KCl
Sucrose Sigma 57-50-1 sucrose
β-Casein from bovine milk Sigma C6905-250MG
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Riferimenti

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Actin CytoskeletonIn Vitro ReconstitutionGiant Unilamellar VesiclesLiposome YieldEncapsulation EfficiencyProtein EncapsulationMicroparticle EncapsulationSelf-propelling MicroswimmersNon-polymerization BufferPolymerization BufferEGGPCNickel Lipid
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Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (186), e64026, doi:10.3791/64026 (2022).
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