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Bioingegneria

In vitro Rekonstitution des Aktinzytoskeletts in riesigen unilamellaren Vesikeln

Published: August 25, 2022
doi:
10.3791/64026
, ,
1Department of Biomedical Engineering,Yale University, 2Systems Biology Institute,Yale University, 3Department of Physics,Yale University

Summary

In diesem Manuskript demonstrieren wir die experimentellen Techniken zur Verkapselung des F-Aktin-Zytoskeletts in riesige unilamellare Lipidvesikel (auch Liposomen genannt) und die Methode zur Bildung einer Kortex-bioimitierenden F-Aktin-Schicht am inneren Blättchen der Liposomenmembran.

Abstract

Das Aktinzytoskelett, die wichtigste mechanische Maschinerie in der Zelle, vermittelt zahlreiche wesentliche physikalische zelluläre Aktivitäten, einschließlich Zellverformung, Teilung, Migration und Adhäsion. Die Untersuchung der Dynamik und Struktur des Aktinnetzwerks in vivo wird jedoch durch die biochemische und genetische Regulation innerhalb lebender Zellen erschwert. Um ein minimales Modell ohne intrazelluläre biochemische Regulation zu erstellen, wird Aktin in riesige unilamellare Vesikel (GUVs, auch Liposomen genannt) eingekapselt. Die biomimetischen Liposomen sind zellgroß und ermöglichen einen quantitativen Einblick in die mechanischen und dynamischen Eigenschaften des Zytoskelett-Netzwerks, was einen gangbaren Weg für die synthetische Bottom-up-Biologie eröffnet. Um Liposomen für die Verkapselung zu erzeugen, wird die invertierte Emulsionsmethode (auch als Emulsionstransfermethode bezeichnet) verwendet, eine der erfolgreichsten Techniken zur Verkapselung komplexer Lösungen in Liposomen, um verschiedene zellnachahmende Systeme herzustellen. Bei dieser Methode wird dem inneren Puffer eine Mischung interessanter Proteine zugegeben, die später in einer phospholipidhaltigen Mineralöllösung zu einschichtigen Lipidtröpfchen emulgiert wird. Die gewünschten Liposomen werden aus einschichtigen Lipidtröpfchen erzeugt, die eine Lipid/Öl-Wasser-Grenzfläche kreuzen. Diese Methode ermöglicht die Verkapselung konzentrierter Aktinpolymere in die Liposomen mit gewünschten Lipidkomponenten und ebnet den Weg für die in vitro Rekonstitution eines bioimitierenden Zytoskelett-Netzwerks.

Introduction

Das Aktinzytoskelett spielt eine grundlegende Rolle beim Aufbau der intrazellulären Architektur der Zelle, indem es die Kontraktilität auf molekularer Ebene und die Krafterzeugung koordiniert 1,2,3. Infolgedessen vermittelt es zahlreiche essentielle zelluläre Aktivitäten, einschließlich Zelldeformation4,5, Division6, Migration 7,8 und Adhäsion9. Die in vitro Rekonstitution von Aktinnetzwerken hat di den letzten Jahren enorme Aufmerksamkeit erlangt 10,11,12,13,14,15,16,17. Das Ziel der Rekonstitution ist es, ein Minimalmodell der Zelle ohne die komplexe biochemische Regulation zu erstellen, die in lebenden Zellen existiert. Dies bietet eine kontrollierbare Umgebung zur Untersuchung spezifischer intrazellulärer Aktivitäten und erleichtert die Identifizierung und Analyse verschiedener Komponenten des Aktinzytoskeletts18,19. Darüber hinaus bietet die Verkapselung von in vitro Aktinnetzwerken in Phospholipid-Riesen-Unilamellenvesikeln (GUVs, Liposomen) einen begrenzten, aber deformierbaren Raum mit einer semipermeablen Grenze. Es ahmt die physiologische und mechanische Mikroumgebung der Aktinmaschinerie innerhalb der Zelle 9,20,21,22 nach.

Unter verschiedenen Methoden zur Herstellung von Liposomen ist die Lipidfilmhydratationsmethode (auch bekannt als Quellmethode) eine der frühesten Techniken23. Der trockene Lipidfilm hydratisiert unter Zugabe von Puffern und bildet membranöse Blasen, die schließlich zu Vesikeln werden24. Um größere Vesikel mit einer höheren Ausbeute zu erzeugen, wendet ein verbessertes Verfahren, das von der Filmhydratationsmethode fortschreitet, bekannt als Elektrobildungsmethode25, ein elektrisches Wechselstromfeld an, um den Hydratationsprozess26 effizient zu fördern. Die Haupteinschränkungen dieser hydratationsbasierten Methoden zur Aktinverkapselung bestehen darin, dass sie eine geringe Verkapselungseffizienz von hochkonzentrierten Proteinen aufweist und nur mit spezifischen Lipidzusammensetzungen kompatibel ist24. Die invertierte Emulsionstechnik hat im Vergleich dazu weniger Einschränkungen für Lipidkomponenten und Proteinkonzentrationen20,27,28,29. Bei diesem Verfahren wird eine Mischung von Proteinen zur Verkapselung in den inneren wässrigen Puffer gegeben, der später in einer lipidhaltigen Mineralöllösung emulgiert wird, wobei Lipid-Monoschicht-Tröpfchen gebildet werden. Die einschichtigen Lipidtröpfchen durchqueren dann durch Zentrifugation eine weitere Lipid/Öl-Wasser-Grenzfläche, um zweischichtige Lipidvesikel (Liposomen) zu bilden. Diese Technik hat sich als eine der erfolgreichsten Strategien zur Aktinverkapselung24,30 erwiesen. Unabhängig davon gibt es einige mikrofluidische Gerätemethoden, einschließlich gepulstes Jetting31,32, transienten Membranauswurf 33 und das cDICE-Verfahren 34. Die Ähnlichkeiten zwischen der inversen Emulsionsmethode und der mikrofluidischen Methode sind das verwendete Lipidlösungsmittel (Öl) und die Einführung einer Lipid/Öl-Wasser-Grenzfläche für die Bildung des äußeren Blattes von Liposomen. Im Gegensatz dazu erfordert die Erzeugung von Liposomen durch das mikrofluidische Verfahren einen Aufbau mikrofluidischer Vorrichtungen und wird von Öl begleitet, das zwischen den beiden Blättchen der Doppelschicht eingeschlossen ist, was einen zusätzlichen Schritt zur Ölentfernung erfordert35.

In diesem Manuskript verwendeten wir die invertierte Emulsionstechnik, um Liposomen herzustellen, die ein polymerisiertes F-Aktin-Netzwerk einkapseln, wie zuvor verwendet22. Die Proteinmischung für die Verkapselung wurde zunächst in einen Puffer mit nichtpolymerisierenden Bedingungen gegeben, um Aktin in seiner globulären (G) Form zu erhalten. Der gesamte Prozess wurde bei 4 °C durchgeführt, um eine frühe Aktinpolymerisation zu verhindern, die später ausgelöst wurde, indem die Probe auf Raumtemperatur erwärmt wurde. Bei Raumtemperatur polymerisiert das Aktin in seine filamentöse (F) Form. Eine Vielzahl von Aktin-bindenden Proteinen kann der inneren wässrigen Pufferlösung hinzugefügt werden, um Proteinfunktionalitäten und -eigenschaften zu untersuchen und so weitere Einblicke in ihre Interaktion mit dem Aktinnetzwerk und der Membranoberfläche zu erhalten. Dieses Verfahren kann auch auf die Verkapselung verschiedener Proteine von Interesse36 und großer Objekte (Mikropartikel, selbstfahrende Mikroschwimmer usw.) nahe der Größe der endgültigen Liposomen 28,37 angewendet werden.

Protocol

1. Herstellung von Puffern und Proteinlösungen Bereiten Sie den wässrigen inneren Nichtpolymerisationspuffer (INP) in einem Gesamtvolumen von 5 ml durch Mischen von 0,1 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM Saccharose und0,2 mM ATP vor. Bereiten Sie den Proteinmix (PM) vor, indem Sie dem INP-Puffer bei 4 °C Proteine mit folgenden Konzentrationen hinzufügen: 11,2 μM nicht-fluoreszierendes G-Aktin, 2,8 μM fluoreszenzmarkiertes Aktin und 0,24 μ…

Representative Results

Die Herstellung von Liposomen auf Basis der inversen Emulsionstechnik ist in Abbildung 1 grafisch und schematisch dargestellt. Zunächst wurden leere (nackte) Liposomen (~5-50 μm Durchmesser) hergestellt, die aus Phospholipid (EPC) und fluoreszierendem Lipid (DHPE) zusammengesetzt waren. Ein heller, tiefroter Fluoreszenzfarbstoff wurde als Kontrollexperiment in nackte Liposomen eingekapselt. Ob sich eine Lipidmonoschicht erfolgreich in der Peripherie des Tröpfch…

Discussion

Mehrere wichtige Schritte bestimmen den Erfolg einer hohen Ausbeute an Liposomen während des Herstellungsprozesses. Um den Lipidfilm im Öl vollständig aufzulösen, muss die Probe beschallt werden, bis der Lipidfilm am Boden der Glasdurchstechflasche vollständig verschwindet. Nach der Beschallung muss das Lipid-Öl-Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur unter dunklen Bedingungen gelagert werden, damit sich die Lipidmoleküle weiter verteilenkönnen 29. Die Mischung kann bis zu einer Woche bei 4…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir bestätigen die Finanzierung von ARO MURI W911NF-14-1-0403 an M.P.M., die National Institutes of Health (NIH) R01 1R01GM126256 an M.P.M., die National Institutes of Health (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 und die Fördernummer RGY0073/2018 des Human Frontiers Science Program (HFSP) an M.P.M. Alle Meinungen, Ergebnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Material zum Ausdruck gebracht werden, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der ARO, NIH oder HFSP wider. S.C. würdigt fruchtbare Gespräche mit V. Yadav, C. Muresan und S. Amiri.

Materials

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)  Avanti Polar Lipids Inc. 231615773 Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane Sigma D27802-25G DABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AKL99-D non-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AR05 fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma A2383-10G ATP
Alexa Fluor 647 dye ThermoFisher fluorescent dye
Andor iQ3 Andor Technologies control and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain Cytoskeleton, Inc RP01P-A Arp 2/3
Calcium chloride dihydrate Sigma 10035048 CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip) Quorum Technologies incubation chamber
Cofilin protein: human recombinant Cytoskeleton, Inc CF01-C cofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective) Andor Technologies LEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA Sigma G7528 glucose
Dithiothreitol DOT Scientific  DSD11000-10 DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant Cytoskeleton, Inc HPG6 gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tip Cole-Parmer UX-07940-53 glass syringe
HEPES AmericanBio 7365-45-9
ImageJ/Fiji https://imagej.net/tutorials/
L-alpha-Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids Inc. 97281442 EPC
Magnesium chloride Sigma 7786303 MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil Sigma 8042475 mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His) VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE) Thermo Fisher O12650 DHPE
Potassium chloride Sigma 7447407 KCl
Sucrose Sigma 57-50-1 sucrose
β-Casein from bovine milk Sigma C6905-250MG
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Riferimenti

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Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (186), e64026, doi:10.3791/64026 (2022).
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