Summary
该协议描述了一种逐步建立感染金黄色葡萄球菌的离体绵羊受伤皮肤模型的方法。与传统微生物学技术相比，这种高通量模型更好地模拟体内感染，并为研究人员提供了一个生理相关的平台来测试新兴抗菌剂的功效。
Abstract
抗菌药物的开发是一个昂贵的过程，成功率越来越低，这使得对抗菌发现研究的进一步投资变得不那么有吸引力。如果在先导物优化阶段可以实施快速失败和廉价失败的方法，那么抗菌药物的发现和随后的商业化可以变得更加有利可图，研究人员可以更好地控制药物设计和配方。本文介绍了一种感染金黄色葡萄球菌的离体绵羊损伤皮肤模型的建立，该模型简单、经济高效、通量高且可重复。模型中的细菌生理学模拟了感染期间细菌增殖取决于病原体破坏组织的能力。伤口感染的建立通过与接种物相比活细菌计数的增加来验证。该模型可用作在先导物优化阶段测试新兴抗菌剂功效的平台。可以说，该模型的可用性将为开发抗菌剂的研究人员提供快速失败和失败便宜的模型，这将有助于提高后续动物试验的成功率。该模型还将促进减少和改进动物用于研究，并最终能够更快，更具成本效益地将用于皮肤和软组织感染的新型抗菌剂转化为临床。
Introduction
皮肤感染是一个重要的全球性问题，给世界各地的医疗保健提供者带来了巨大的经济成本。病原体对多重耐药性和生物膜形成的发展在伤口不愈合的流行中起着关键作用1，2，3，4。因此，皮肤和软组织感染是延长住院和随后再次入院的更常见原因之一5。伤口愈合的延迟对患者和医疗保健提供者来说都是代价高昂的，据估计，美国每年约有 650 万患者受到影响。在英国，皮肤感染和相关并发症每年导致约75，000人死亡2，4，6。
金黄色葡萄球菌（S. aureus） 是一种强大的伤口病原体，经常从患者伤口中分离出来2，7。多重耐药性的出现率在2000年代急剧增加。在此期间，大约 60% 的急性细菌性皮肤和皮肤结构感染对耐甲氧西林 金黄色葡萄球菌1 呈培养阳性。在过去20年中， 葡萄球菌和其他病原体中耐多药菌株的数量不断增加，这表明迫切需要快速开发具有克服耐药性的新作用模式的抗生素。
然而，自 2000 年代初以来，抗生素发现计划一直以较长的开发时间和低成功率为主，只有 17% 的新型抗生素进入美国临床试验获得市场批准8.这表明新兴抗生素的 体外 检测结果与其临床结果之间存在差异。可以争辩说，这种差异主要是由于 体内 感染期间细菌生理学的差异以及在 体外 临床前阶段测试抗生素功效时常规微生物学方法的差异。因此，需要更能代表感染期间细菌生理学的新型实验室方法，以提高抗生素发现计划的成功率。
目前研究皮肤感染的方法包括活体动物（例如小鼠）、离体皮肤模型（例如猪）和3D组织工程皮肤模型（例如人类）的研究9，10，11，12。对活体动物的研究受到严格监管，通量相对较低。在动物模型中，伤害和感染会给动物带来巨大的痛苦，并引起伦理问题。人体皮肤模型，离体或组织工程，需要伦理批准，遵守当地和全球立法（人体组织法，赫尔辛基宣言），并且难以获得组织，有些要求需要数年才能满足13，14。这两种模型类型都是劳动密集型的，需要大量的专业知识才能确保实验成功。目前一些离体皮肤感染模型需要预先接种的椎间盘和伤口床添加剂才能使感染;尽管这些模型非常有用，但在感染过程中存在局限性，因为添加剂限制了伤口床作为营养来源的利用10，15，16，17。本研究中描述的模型不对伤口床使用添加剂，这确保了感染的病理学和活细胞计数是直接利用伤口床作为唯一营养来源的结果。
鉴于对新实验室方法的需求，已经开发出一种用于评估新兴抗生素疗效的新型高通量离 体 羊皮肤感染模型。皮肤感染研究面临许多挑战 - 高成本，伦理问题和无法显示全貌的模型20，21。 离 体模型和3D外植体模型可以更好地可视化疾病过程以及更具临床相关性的模型对治疗的影响。这里描述了一种新的绵羊皮肤模型的建立，该模型简单，可重复，临床相关且具有高通量。选择绵羊皮肤是因为绵羊是通常用于模拟 体内感染反应的大型哺乳动物之一。此外，它们很容易从屠宰场获得，确保为研究提供稳定的皮肤供应，并且它们的尸体不会被烫伤，确保良好的组织质量。这项研究使用 金黄色葡萄球菌 作为典型病原体;但是，该模型适用于其他微生物。
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Protocol
来自R.B Elliott和Son屠宰场的羔羊头被用作该项目的皮肤样本来源。所有的羔羊都被宰杀作为食物食用。这些没有丢弃头部，而是被重新用于研究。不需要道德批准，因为组织来自屠宰场丢弃的废物。
1. 灭菌
- 在收集头部之前对镊子进行消毒，方法是取干净的镊子并在200°C的烤箱中进行干热灭菌1小时。使用前将所有玻璃器皿在121°C高压灭菌15分钟。
- 在微生物学2级机柜内执行所有描述的工作。按照制造商的说明准备所有试剂。
2. 样品采集
- 在屠宰场，斯瓦勒代尔羔羊被电击或俘虏螺栓手枪击杀并放血。屠宰后不超过4小时收集羊头。
3. 头部的准备
- 将大约 100 mL 的 200 ppm 二氧化氯溶液倒入样品区域，对羊肉的前额部分进行消毒。使用电动剪剃除头部的前额部分，并用 200 mL 的 200 ppm 二氧化氯溶液清洗该区域。
- 用乙醇和蓝卷擦拭该区域，并用脱毛膏覆盖样品区域35分钟。使用刮刀工具轻轻刮掉脱毛膏并评估样品区域。如果留下大量毛发，请重复脱毛过程。
- 再使用200mL二氧化氯溶液冲洗该区域，然后用乙醇冲洗并用蓝卷擦拭。
- 使用无菌的8毫米活检打孔器，从制备的区域切出8毫米的皮肤样本。使用无菌镊子和 15 刀片手术刀取出样品，确保去除所有皮肤脂肪。
- 将样品放入装有无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）的无菌0.5L罐中，然后用50mL的200ppm二氧化氯溶液将其转移到无菌的50mL管中，倒置两次，并灭菌30分钟。
- 从二氧化氯溶液中取出样品，并通过将它们放入装有 40 mL 无菌 PBS 的 50 mL 管中来洗涤它们。洗涤后，将每个单独的皮肤样品放入24孔板的单独孔中。
- 加入 350 μL 预热培养基，同时将样品保持在气液界面。培养基的组成如下：MK培养基（含有汉克斯盐、L-谷氨酸和1.75 mg/mL碳酸氢钠的培养基199）和Ham's F12，比例为1：1，添加FBS（10% v/v）、EGF（10 ng/mL）、胰岛素（5μg/mL）、青霉素-链霉素（100 U/mL）和两性霉素B（2.5μg/mL）。
- 用透气板密封密封24孔板，并在37°C下在加湿的5%CO2 组织培养箱中孵育长达24小时。
4. 皮肤样品的维护
- 孵育后，取出培养基并在 500 μL 无菌 PBS 中冲洗样品。向每个样品中加入无抗生素培养基，并在37°C下在加湿的5%CO2 组织培养箱中孵育24小时以除去样品中的残留抗生素。
- 如果在24小时后在无抗生素培养基中出现浑浊或真菌感染，则丢弃样品。
5. 接种物的制备
- 准备一个 50 mL 的管子和 10 mL 无菌胰蛋白酶大豆肉汤。取新鲜的 金黄色葡萄球菌 琼脂平板，用拭子将几个菌落转移到肉汤中。在37°C以150rpm孵育18小时。
- 以4，000× g 离心3分钟。除去上清液并将细胞沉淀重悬于10mL无菌PBS中。重复两次以确保充分洗涤细胞。
- 在无菌PBS中将接种物调节至0.6 OD600 。通过进行手动活板计数来确认接种量。
6.皮肤样本感染
- 用 400 μL 预热的无抗生素培养基制备新鲜的 24 孔板，并使用无菌镊子加入 24 孔插入物。
- 从皮肤样品中取出培养基，用 500 μL 无菌 PBS 洗涤，然后取出洗涤液。使用无菌镊子将样品轻轻地固定在孔底部。
- 使用 4 mm 穿刺活检制作中央伤口瓣，刺穿至 1-2 mm 的粗糙深度。然后，使用 15 刀片手术刀和无菌齿状茴苣组织钳去除伤口皮瓣的顶层。伤口尺寸的变化可能会影响感染的结果和终点集落形成单位（CFU）。
- 一旦所有样品都被伤住，使用无菌镊子将它们转移到24孔插入物中。将15μL细菌接种物移液到伤口床中。然后，在加湿的5%CO2 组织培养箱中于37°C孵育24小时。
- 如果需要更长的孵育期，请每24小时取出培养基并用新鲜培养基替换，并在相同条件下孵育。
7. 细菌负荷量的测定
- 从孔底部取出培养基。使用无菌镊子将每个样品转移到装有 1 mL 无菌 PBS 的单独 50 mL 管中。
- 使用细尖均质器使样品表面均质化。注意确保伤口床与均质机的尖端直接接触。
- 在中/高下均质每个样品35秒。均质机将细菌从伤口床表面分离，以允许计数细菌负荷。
- 处理完所有样品后，在移液前依次涡旋每个样品。这是为了确保细菌匀浆混合。
- 将 20 μL 涡旋匀浆移液到含有 180 μL 无菌 PBS 的 96 孔板的相应孔中。
- 将每个样品匀浆连续稀释至 1 x 10−7 ，并将 10 μL 稀释的匀浆移液到胰蛋白酶大豆琼脂平板上一式三份。
- 将琼脂平板在37°C孵育18小时。 然后，计算菌落数以确定每个样品的CFU。
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Representative Results
在建立伤口感染模型之前确定对皮肤进行消毒的途径具有挑战性。挑战在于在不损害不同皮肤层的情况下对皮肤进行消毒，这可能会继续对感染结果产生意想不到的后果。为了确定适当的灭菌方案，如 表1所示，在不同的时间内尝试了不同的处理方法。污染记录为用于维持皮肤样品的MK培养基中48小时后浑浊的发展。通过组织学监测组织完整性，然后在处理后立即用苏木精和伊红（H&E）染色（图1）。用二氧化氯处理30分钟被证明在可重复地对皮肤组织进行消毒的同时保持组织完整性方面最有效。
在实验设置中，将受伤的无菌组织放置在气液界面处的24孔插入物的顶端室中（图2A）。尝试了两种不同的损伤技术 - 皮瓣去除技术，其中组织通过打孔活检工具受伤，并使用15刀片手术刀和无菌齿状葱组织钳的组合去除受伤组织的顶层，以及划伤技术，其中组织仅通过打孔活检工具受伤。尽管划痕模型在24 h后的平均CFU数量较高，但结果是可变的。皮瓣去除技术产生了更一致的结果（图2C）。48小时后，与接种物相比，从受伤组织中回收的细菌CFU大约多100倍（图2D）。这被认为表明感染成功。感染后48小时，伤口床上的白色薄膜在组织上很明显（图2B）。感染组织的革兰染色组织学切片表明伤口床中存在 金黄色葡萄球菌 细胞（图2E，F）。提供未感染组织的革兰染色组织学切片作为比较器（图2G，H）。
从一个羊头上，可以真实地访问 100 cm2 部分（10 cm x 10 cm）。鉴于使用直径为8毫米的圆形穿孔活检将每块皮肤从额头中穿出，每周可以从一只羔羊的额头中获得大约100个皮肤斑块。购买更多的羔羊头会成比例地增加每周可以获得的皮肤样本数量。因此，据称该程序的吞吐量相对较高。在这项研究中，每周常规获取24个皮肤样本。来自各种羔羊头部的皮肤被处理为生物学复制品，以解释潜在的供体到供体之间的差异。在皮肤贴片的制备过程中（步骤3.1-3.8），主要的时间消耗是皮肤样品在二氧化氯溶液中孵育30分钟和等待脱毛霜治疗的2 x 35分钟。使用穿刺活检生成 24 个皮肤贴片大约需要 15 分钟。如果增加皮肤斑块的数量，这个时候会线性扩展。
| 消毒剂 | 10 分钟 | 30 分 | 60 分 |
| 1%高级医用表面消毒剂 | F | P | P |
| 1%多用途消毒剂 | F | F | P |
| 3%聚维酮 | F | F | F |
| 5%聚维酮 | F | P | P |
| 10%聚维酮 | F | P | P |
| 70%乙醇 | F | P | P |
| 紫外线 | F | F | F |
| 0.55%次氯酸盐 | F | P | P |
| 200 ppm 二氧化氯 | F | P | P |
表1：新鲜羊皮的灭菌。 将每个皮肤样品留在消毒剂中指定时间。F 表示未能对组织进行灭菌，培养基中存在细菌污染。P表示通过，培养基中不存在细菌污染。
图1：在100倍放大镜下用消毒剂（H&E染色）处理的未感染的e x 体内 绵羊皮肤的组织学。 （A）在PBS中用30分钟处理控制皮肤样品。可以看到一些表皮脱落，但表皮没有被破坏。（B）用1%高级医用表面消毒剂处理的绵羊皮肤30分钟。表皮脱落（黑色箭头）以及对颗粒层的一些破坏（蓝色箭头）。（C）用5%聚维酮处理的绵羊皮肤30分钟。这里可以看到组织中度损伤，表皮角质层脱落（黑色箭头）。对下表皮层的破坏最小。（D）用10%聚维酮处理的绵羊皮肤30分钟。表皮的顶层已经受损，有脱落（黑色箭头）和变薄（绿色箭头）的迹象。（E）用2%多用途消毒剂处理的绵羊皮肤30分钟。可以观察到样品的严重损坏，表皮脱落明显（黑色箭头）和角质层完全根除（红色箭头）。（F）在200ppm二氧化氯中处理的绵羊皮肤30分钟。可以看到一些表皮脱落，但表皮完好无损。（G）用0.6%次氯酸盐处理的绵羊皮肤30分钟。存在对表皮的严重损害，表皮脱落水平高（黑色箭头）和某些地方的表皮根除（红色箭头）。（H）用70%乙醇处理的绵羊皮肤30分钟。可见表皮损伤，表皮脱落明显（黑色箭头）。比例尺为 200 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图2：感染金黄色葡萄球菌的离体绵羊皮肤。 （A）实验装置示意图。（B）感染前（左图）和感染48小时后（右图）离体羊皮肤的图片。注意在感染组织中孵育48小时后出现的白色薄膜，在未感染的组织中不存在。（C）测试不同损伤方法对均质后最终菌落形成单位（CFU）计数的影响。皮瓣去除（n = 6）和划痕（n = 9）感染金黄色葡萄球菌24小时。误差线表示标准偏差。表示 p 值< 0.0001。（D）测试均质化后孵育时间对CFU计数的影响。24小时孵育（n = 6）和48小时孵育（n = 12）。误差线表示标准偏差。表示 p 值< 0.0001。（中、女）感染48小时后感染绵羊皮肤的组织病理学分析的代表性图像，在100倍放大倍率（200μm的比例尺）下用改良的革兰染色（E）。该框表示在 1，000 倍放大（比例尺为 50 μm）下以 （F） 为单位放大的区域。黑色箭头表示细菌。（G，H）在100倍放大倍率（比例尺为200μm）下使用改良的gGram染色（G）进行48小时（对照）后未感染绵羊皮肤组织病理学分析的代表性图像。该框表示在 1，000 倍放大（比例尺为 50 μm）下放大的区域（H）。统计分析作为单因素方差分析进行。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
抗菌剂的开发是一项重要但昂贵的冒险，估计耗资约10亿美元，大约需要15年才能完成。超过90%的抗菌药物发现和抗菌药物疗效的临床前研究是由学术研究人员和通常少于50名员工的中小型公司进行的22。这些团队在财务上非常拮据，这使得铅分子在转化研究后期阶段的失败是灾难性的。抗微生物药物耐药性的上升速度超过了新型抗菌药物的发展速度，这进一步加剧了负责任地管理本已有限的抗微生物药物研究投资的需求23。
体内和体外实验室培养物感染之间的细菌生理学差异往往导致在先导物鉴定阶段高估命中物的抗菌功效。这种高估导致了在翻译的后续阶段出现的高流失率。体外抗菌功效测试平台的可用性，这些平台将细菌与生理学相结合，更好地模仿体内感染期间发现的细菌，将能够更准确地估计抗菌功效，并为研究人员提供对铅优化的更大控制，而无需依赖昂贵且严格监管的动物试验。这些模型还将降低后续翻译阶段的损耗率，并可能使抗菌药物的发现对投资更具吸引力。
这里描述的这种绵羊皮肤感染模型是一种有用的工具，它将为研究人员提供感染伤口的生理相关体外模型，以测试新兴局部抗菌制剂在临床前阶段的功效。与科学文献10，15，24，25，26，27，28中描述的大多数离体感染模型相反，在该模型中，暴露于离体组织的病原体在感染期间不补充培养基。病原体增殖和随后的感染取决于生物体损伤组织的能力。因此，与传统微生物培养相比，该模型中的病原体生理学与体内感染期间的病原体生理学关系更密切。从该模型获得高度可重复的感染，通过孵育后从组织中取出的CFU数量来判断。
由于人类皮肤等效物过多以及人类和猪离体伤口模型，在该模型中使用绵羊组织可能被表面上认为是一种限制。然而，绵羊是用作体内感染模型的大型动物群体之一 29，30，31。此外，绵羊在免疫学研究和疫苗开发中被用作人类的替代品，表明它们的免疫反应与人类相似32。伤口愈合期间的组织修复过程在大型哺乳动物（包括绵羊和人类）中相似33，34，并且已在绵羊中成功证明的改善伤口愈合的干预措施已被建议转化为人类35，36，37。因此，在该伤口模型中使用离体绵羊皮肤并不是一种限制。此外，由于以下原因，该绵羊模型可以被认为是包含人类或猪皮肤的模型的可靠替代品。人体皮肤的供应有限，即使有，质量也参差不齐38.组织工程人表皮和活皮肤等效物需要在其培养条件下进行改进，以确保组织生理学的可重复性39。虽然猪皮比人皮更容易获得，但广泛使用的猪皮作为屠宰场胴体加工的一部分被烫伤，去除表皮10。根据经验，屠宰场不太容易获得未烫伤的猪皮。
在这里描述的整个协议中，有一些关键步骤可以确保模型的成功。最关键的一步是在收获后对组织进行灭菌。二氧化氯溶液必须与组织样品混合，并且必须允许30分钟的接触时间对组织进行充分消毒并去除污染物。此外，在设置此实验时，由于处理不当或使用消毒剂和抗生素培养基处理无效，可能会发生浑浊或真菌污染。在这种情况下，必须丢弃产生浑浊的样品。为了减少浑浊和污染的发展，实验室环境应保持清洁，经常对培养箱进行灭菌，使用过滤器尖端，并确保与样品一起使用的工具和容器完全灭菌。协议中的另一个关键步骤是当使用4毫米活检冲头来伤口组织时。使用该工具允许类似尺寸的伤口床，以确保方案的可重复性和可重复性。伤口床尺寸的变化会影响终点CFU。当组织皮瓣充分去除时，结果更加一致。与终点CFU计数完整性相关的另一个关键步骤是使用细头均质机来释放细菌细胞。均质器尖端的位置被认为对样品之间的CFU计数有影响;当尖端直接正确放置在伤口床上时，样品之间的变异性要小得多。
然而，这里提出的模型并非没有局限性。该模型具有所有 离体 研究固有的局限性（即缺乏活跃的血管流动，缺乏可能调节感染进展的共生微生物群以及缺乏免疫细胞）。可以说，由于 离 体伤口模型不包含活性免疫细胞，因此在这些细胞存在下的 体内 感染进展可能与 离体 模型中观察到的感染进展不同。无论如何， 离体 模型为附着提供了组织表面和细菌的营养来源，并为配方提供了3D扩散屏障，与传统的微生物培养技术相比，可以更准确地评估抗菌功效。
该模型的一个关键优点是组织来自为人类消费而种植的羔羊。更具体地说，该模型重新利用了羊羔头的皮肤，这些皮肤通常被丢弃。此外，该模型具有高通量，可实现经济高效、快速且可重复的比较研究。可以说，这种模式的可用性将减少和完善对符合三个R原则的转化研究目的培育动物的需求，这促进了更人道的研究实践。尽管此处描述的模型将 金黄色葡萄球菌 作为示例病原体，但该模型可以与其他微生物一起使用，包括其他细菌，真菌和病毒，从而扩大了该模型支持的药物开发范围。可以设想，该模型的使用将通过为研究人员在临床前阶段提供对药物设计和配方的更大控制，使急需的抗生素能够快速转化皮肤感染。
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Disclosures
作者没有什么可透露的
Acknowledgments
作者要感谢EPSRC（EP/R513313/1）的资助。作者还要感谢切斯特菲尔德卡洛的R.B Elliot和Son屠宰场提供羊头并在项目的早期阶段如此包容，感谢Kasia Emery在整个协议开发过程中的支持，以及谢菲尔德大学感染，免疫和心血管疾病系的Fiona Wright处理组织学样本，并在整个项目中提供了令人难以置信的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
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