Summary
Le présent protocole décrit une injection en deux points de lysophosphatidylcholine via un cadre stéréotaxique pour générer un modèle de démyélinisation stable et reproductible chez la souris.
Abstract
La signalisation des lysophospholipides médiée par les récepteurs contribue à la physiopathologie de diverses maladies neurologiques, en particulier la sclérose en plaques (SEP). La lysophosphatidylcholine (LPC) est un lysophospholipide endogène associé à l’inflammation, et il pourrait induire des dommages rapides avec une toxicité pour les lipides de myéline, conduisant à la démyélinisation focale. Ici, un protocole détaillé est présenté pour l’injection stéréotaxique de LPC en deux points qui pourrait directement provoquer une démyélinisation sévère et reproduire la lésion expérimentale de démyélinisation rapidement et de manière stable chez la souris par une intervention chirurgicale. Ainsi, ce modèle est très pertinent pour les maladies de démyélinisation, en particulier la SEP, et il peut contribuer à l’avancement connexe de la recherche cliniquement pertinente. En outre, l’immunofluorescence et les méthodes de coloration bleue rapide Luxol ont été utilisées pour décrire l’évolution temporelle de la démyélinisation dans le corps calleux de souris injectées avec LPC. En outre, la méthode comportementale a été utilisée pour évaluer la fonction cognitive des souris après modélisation. Dans l’ensemble, l’injection en deux points de lysophosphatidylcholine via un cadre stéréotaxique est une méthode stable et reproductible pour générer un modèle de démyélinisation chez la souris pour une étude plus approfondie.
Introduction
La signalisation des lysophospholipides médiée par les récepteurs implique divers processus physiologiques de presque tous les systèmes d’organes1. Dans le système nerveux central (SNC), cette signalisation joue un rôle essentiel dans les pathogenies des maladies neurologiques auto-immunes telles que la sclérose en plaques (SEP). La sclérose en plaques est un trouble chronique à médiation immunitaire caractérisé par une démyélinisation pathologique et une réponse inflammatoire, provoquant un dysfonctionnement neurologique et des troubles cognitifs 2,3. Après une rechute et une rémission continues au début de la maladie, la plupart des patients finissent par passer au stade secondaire-progressif, ce qui pourrait causer des dommages irréversibles au cerveau et une invalidité résultante4. On pense que la caractéristique pathologique de l’évolution secondaire-progressive est les plaques démyélinisantes causées par des lésions inflammatoires5. Les traitements existants de la SP peuvent réduire considérablement le risque de rechute. Cependant, il n’existe toujours pas de traitement efficace pour les dommages démyélinisants à long terme causés par la SEPprogressive 6. Ainsi, un modèle stable et facilement reproductible est nécessaire pour étudier les thérapies précliniques qui se concentrent sur la dégénérescence de la substance blanche.
La démyélinisation et la remyélinisation sont deux processus pathologiques majeurs dans le développement de la sclérose en plaques. La démyélinisation est la perte de gaine de myéline autour des axones induite par la microglie avec des phénotypes pro-inflammatoires7, et elle conduit à une conduction lente de l’influx nerveux et entraîne la perte de neurones et de troubles neurologiques. La remyélinisation est une réponse de réparation endogène médiée par des oligodendrocytes, où les troubles pourraient entraîner une neurodégénérescence et des troubles cognitifs8. La réponse inflammatoire est cruciale pour l’ensemble du processus, affectant à la fois le degré de lésion de la myéline et la réparation.
Par conséquent, un modèle animal stable de démyélinisation inflammatoire persistante est utile pour explorer plus avant les stratégies thérapeutiques pour la SEP. En raison de la complexité de la SEP, divers types de modèles animaux ont été établis pour imiter les lésions démyélinisantes in vivo, y compris l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), les modèles toxiques-démyélinisants, la cuprizone (CPZ) et la lysophosphatidylcholine (LPC)9 . Le LPC est un lysophospholipide endogène associé à l’inflammation, et il pourrait induire des dommages rapides avec une toxicité pour les lipides de myéline, conduisant à la démyélinisation focale. Sur la base de rapports précédents et de recherches10,11, un protocole détaillé d’injection en deux points avec quelques modifications est fourni. Généralement, le modèle d’injection LPC classique en un point ne produit qu’une démyélinisation locale au site d’injection et s’accompagne souvent d’une remyélinisation spontanée12,13. Cependant, le modèle LPC à injection en deux points peut démontrer que le LPC peut directement induire une démyélinisation dans le corps calleux de la souris et provoquer une démyélinisation plus durable avec peu de régénération de la myéline.
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Protocol
Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité de l’Institut des soins aux animaux du Tongji Medical College, Université des sciences et de la technologie de Huazhong, en Chine. Des souris mâles et femelles adultes C57BL/6 (type sauvage, WT; 20-25 g; 8-10 semaines) ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été obtenues à partir de sources commerciales (voir tableau des matériaux). Les souris ont été hébergées dans une installation spécifique exempte d’agents pathogènes (FPS) avec de l’eau et de la nourriture fournies ad libitum. Ils ont été maintenus dans une période alternée de 12 h de cycle clair et sombre dans les conditions standard de température de 22 °C et d’humidité relative de 55% à 60%.
1. Préparation de la solution LPC
- Dissoudre 25 mg de poudre de LPC (voir tableau des matériaux) avec 250 μL de chloroforme et de solution mélangée de méthanol (1:1) pour obtenir une solution de LPC à 10 % et la transférer dans un tube de centrifugeuse de 500 μL.
REMARQUE: Si le LPC n’est pas complètement dissous, placez le tube de centrifugeuse dans un nettoyeur à ultrasons et ultrasonez à 40 kHz pendant environ 1 h pour obtenir une solution uniforme. - Répartir la solution en 3 μL/tube et conserver à −80 °C.
REMARQUE: La solution peut être stockée pendant environ 2 ans. - Avant la chirurgie, diluer la solution (étape 1.2.) avec 27 μL de solution de NaCl à 0,9 % et conserver la solution dans un bain-marie à température constante à 37 °C.
REMARQUE: Préparez la solution juste avant de commencer l’injection.
2. Préparation chirurgicale
- Utilisez une aiguille de 32 G, 2 pouces pour vous connecter à une seringue de 5 μL (voir tableau des matériaux). Assurez-vous que la seringue microlitre n’est pas obstruée. Prélever 5 μL de solution de LPC pour la préparation de l’injection.
- Anesthésier la souris dans une chambre d’induction reliée à un vaporisateur d’isoflurane avec 3% d’isoflurane mélangé à 100% d’oxygène à une vitesse d’environ 0,3 L / min.
- Confirmez la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réflexe de pincement des orteils pendant que la respiration est douce.
- Rasez la tête de la souris entre les oreilles à l’aide d’un rasoir électrique. Appliquez des gouttes oculaires lubrifiantes pour prévenir la sécheresse de la cornée pendant la procédure.
- Ensuite, positionnez la souris dans un cadre stéréotaxique (voir Tableau des matériaux) avec la face dorsale vers le haut et fixez la tête avec un cône de nez et une pince à dents. Maintenir l’anesthésie avec 1,2% -1,6% d’isoflurane par le nez.
REMARQUE: La concentration d’isoflurane peut être ajustée en fonction de l’état respiratoire des souris.
3. Intervention chirurgicale
REMARQUE: Les animaux sont placés sur un coussin chauffant pendant toutes les procédures.
- Fixez la souris à l’appareil stéréotaxique avec des barres d’oreille bilatérales. Assurez-vous que les barres d’oreille sont de niveau et que la tête est horizontale et stable.
- Désinfectez la peau de la tête en essuyant plusieurs fois avec de l’iodophore suivi d’alcool en mouvement circulaire. Utilisez ensuite un scalpel pour couper une petite incision d’environ 1,5 cm le long de la ligne médiane du cuir chevelu pour exposer le crâne.
- Essuyez le crâne avec un coton-tige trempé dans du peroxyde d’hydrogène à 1% jusqu’à ce que la fontanelle bregma, lambda et postérieure soit exposée. Placez la seringue sur l’appareil stéréotaxique.
REMARQUE: Utilisez le peroxyde d’hydrogène avec précaution et évitez de toucher les tissus environnants. - Assurer le positionnement horizontal de la tête de l’animal (avant et arrière et gauche et droite).
- Ajustez le bouton de l’axe Z du cadre stéréotaxique de sorte que la pointe de l’aiguille et le crâne se touchent sans se plier, puis mesurez la coordonnée de l’axe Z. Vérifiez les coordonnées Z de bregma et de la fontanelle postérieure.
- Ajustez la barre auriculaire de sorte que la différence entre les coordonnées Z de bregma et de fontanelle postérieure ne dépasse pas 0,02 mm. Ensuite, suivez la même méthode pour mesurer les coordonnées Z des positions correspondantes sur les côtés gauche et droit de la ligne médiane. Ajustez la barre auriculaire pour vous assurer que la gauche et la droite sont au même niveau.
- Localisez le corps calleux. Définissez l’origine XYZ sur bregma.
REMARQUE: Le premier site d’injection est de 1,0 mm latéral au bregma, de 2,4 mm de profondeur et de 1,1 mm antérieur. Le deuxième site d’injection est de 1,0 mm latéral au bregma, de 2,1 mm de profondeur et de 0,6 mm antérieur. Par exemple, la coordonnée du bregma est (0,0,0). Mesurez la coordonnée Z de l’emplacement correspondant marqué comme (-1, 1,1, X) et (-1, 0,6, Y). On peut déterminer que la première coordonnée du site d’injection du corps calleux est (-1, 1,1, −[X + 2,4]), et que le deuxième site d’injection est (-1, 0,6, −[Y + 2,1]). - Une fois le site d’injection déterminé, faites une marque avec un marqueur stérile sur le crâne et enregistrez les coordonnées.
- Percez doucement le site marqué avec une perceuse à crâne (voir Tableau des matériaux). Prenez soin d’éviter tout saignement.
- Déplacez lentement l’aiguille aux coordonnées données et commencez l’injection. Pour induire la démyélinisation du corps calleux, injecter 2 μL de solution de LPC (étape 1.) à chaque site d’injection (étape 3.5.) à raison de 0,4 μL/min.
- Après l’injection, conservez l’aiguille dans chaque site pendant 10 minutes supplémentaires.
REMARQUE: Assurez-vous que l’intervalle de deux injections ne dépasse pas 20 min. - Suturez la peau avec une suture 4-0 et attendez que l’animal se réveille dans les 10 minutes. Administrer les analgésiques après l’opération conformément à la réglementation institutionnelle en matière de soins aux animaux.
REMARQUE: Le temps recommandé pour l’euthanasie peut être déterminé en fonction du but de l’expérience.
4. Extraction d’échantillons pour la démyélinisation focale
REMARQUE: Pour plus de détails concernant cette étape, veuillez consulter le rapport14 publié précédemment.
- Dissoudre le colorant rouge neutre (voir tableau des matériaux) dans une solution à 1 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- quelques heures avant de sacrifier les souris (pour plus de détails, voir la référenceprécédente 10), injecter 500 μL de colorant rouge neutre à 1 % dans le PBS par injection intrapéritonéale pour chaque souris.
- Effectuer une perfusion cardiaque12 avec 30 mL de PBS à 0,1 % prérefroidi à 4 °C.
- Découpez le cerveau en 1 mm avec un moule cérébral (voir Tableau des matériaux).
- Visualisez la lésion colorée avec du rouge neutre au microscope et dissociez la lésion.
REMARQUE: Enlevez autant de tissu normal environnant que possible pour améliorer la précision de l’analyse ultérieure. Le tissu lésionnel peut être examiné par RT-PCR, microscopie électronique et analyses par transfert western.
5. Coloration histologique et immunofluorescence
- Pour la coloration histologique et l’immunofluorescence12, après perfusion cardiaque (étape 4.3.), retirez le cerveau10, fixez 4% de PFA pendant la nuit (à 4 ° C) et déshydratez complètement dans 30% de saccharose.
- Couper en sections coronales du cerveau de 20 mm à l’aide d’une trancheusecongelée 10 à température constante (−20 °C).
- Utilisez les tranches pour la coloration Luxol fast blue (LFB), l’immunofluorescence et le western blot10.
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Representative Results
L’injection en deux points du LPC a entraîné une démyélinisation plus durable
Le LPC entraîne principalement des dommages rapides avec toxicité pour la myéline et clivage de l’intégrité de l’axone15. Le jour de l’injection était considéré comme le jour 0. Les souris ont été gardées pendant une période de 10 à 28 jours (10 dpi et 28 dpi). La coloration Luxol fast blue (LFB)10 a été utilisée pour évaluer la zone de démyélinisation chez la souris à ces points temporels. Dans le modèle d’injection en deux points, il y avait une démyélinisation significative sur le groupe 10 dpi par rapport au groupe simulé, montrant que l’injection localisée de LPC peut démyéliniser avec succès le corps calleux. Un degré relativement élevé de démyélinisation existe toujours à 28 dpi, ce qui indique une démyélinisation persistante et stable due à l’injection de LPC en deux points (Figure 1D-E).
Pour évaluer davantage la perte de gaine de myéline, 10 jours ont été choisis comme point de temps clé lorsque la démyélinisation est relativement apparente. Grâce à la coloration par immunofluorescence de la protéine de base de la myéline dégradée (dMBP), une augmentation remarquable du dMBP a été observée dans le groupe injecté de LPC à 10 dpi (Figure 1F), ce qui représente la perte de myéline dans le corps calleux. De plus, la protéine du tissu lésionnel obtenue (étape 4.) a été utilisée pour analyser l’expression du MBP par transfert western. Après modélisation selon le protocole, MBP a montré une perte significative (Figure 1G). Ces résultats étaient cohérents avec le LFB et la coloration par immunofluorescence.
La morphologie de la myéline dans le corps calleux 10 jours après l’injection de LPC a été observée au microscope électronique (le tissu lésionnel a été extrait selon l’étape 4.). La démyélinisation évidente vérifie le succès de la modélisation (Figure 2).
L’injection de LPC en deux points a influencé la régénération de la myéline
La différenciation et la maturation des oligodendrocytes (OLG) jouent un rôle crucial dans la réparation de la gaine de myéline dans la SEP. La régénération de la myéline se produit principalement en différenciant les cellules précurseurs des oligodendrocytes (OPC) en oligodendrocytes myélinisants. Ainsi, le processus de réparation de la myéline sera influencé une fois que la différenciation des OPC en OLG sera bloquée. Gst-π est le marqueur de la maturation de différenciation OPC16. Après 10 jours d’injection de LPC, on peut voir par immunofluorescence que la tpst-π diminué par rapport au groupe simulé (Figure 3A). Dans le même temps, la capacité de prolifération des oligodendrocytes peut être reflétée par le rapport entre Ki67 (les oligodendrocytes prolifèrent) et Olig2 (cellules de lignée oligodendrocytes totales)17,18. Le rapport de colocalisation Ki67/Olig2+ plus élevé représente une plus grande prolifération d’oligodendrocytes après 10 dpi (Figure 3B). Ces images suggèrent que la zone de la lésion tente de se réparer par la maturation et la prolifération des OPC après l’injection de LPC.
L’injection de LPC en deux points a altéré la mémoire spatiale des souris
Pour analyser la capacité de mémoire spatiale de l’injection de LPC chez la souris, le labyrinthe d’eau de Morris (WMM)19 a été utilisé et n’a montré aucune différence de vitesse de nage entre les souris simulées et les souris injectées par LPC. Cependant, lorsque la plate-forme a été retirée dans le labyrinthe d’eau de Morris, la latence pour trouver la plate-forme cachée a été réduite (apprentissage spatial altéré) et le temps passé dans le quadrant cible a augmenté (rétention de la mémoire altérée) (Figure 4). Les résultats suggèrent que la mémoire spatiale des souris démyélinisées est significativement altérée dans le modèle d’injection de LPC à deux points. Le nombre d’animaux utilisés dans différentes expériences est indiqué dans le tableau 1. Chaque souris a reçu une formation à partir du jour 2 ou du jour 20.
Figure 1 : Injection en deux points de la démyélinisation induite par le LPC. (A) Représentation des sites d’injection (1,0 mm latéral, 2,4 mm de profondeur et 1,1 mm antérieur). (B) Représentation des sites d’injection (1,0 mm latéral, 2,1 mm de profondeur et 0,6 mm antérieur). (C) Illustration des points temporels de détection. (D) Détection des lésions de la substance blanche par coloration LFB. Coloration LFB 10 jours après l’injection (dpi) et 28 dpi, montrant une démyélinisation persistante du corps calleux (barre d’échelle = 200 μm). (E) Quantification de la zone de démyélinisation à différents moments. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SD, anova unidirectionnelle suivie des multiples tests de comparaison de Bonferroni. ****p < 0,0001, n = 6 par groupe. (F) Images représentatives de l’immunocoloration du dMBP dans le corps calleux (barre d’échelle = 100 μm). Comparé à l’imposture, qui n’avait presque pas de dMBP, un dMBP évident pouvait être vu après l’injection de LPC. (G) Analyse par transfert western de l’expression du MBP. Mbp a montré une perte significative après l’injection de LPC. β-actine a été utilisé comme contrôle de charge pour mesurer l’expression de base. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Les images de microscopie électronique confirment l’ultrastructure myélinisée dans le corps calleux de l’imposture par rapport à celle démyélinisée chez les souris injectées par LPC (barre d’échelle = 1 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 : L’injection en deux points a influencé la maturation et la prolifération des OPC. (A) Images représentatives de la tps π dans le corps calleux de souris simulées et injectées de LPC (barre d’échelle = 20 μm). Le rouge signifie TPS-π. (B) Images représentatives de la colocalisation Olig2 et Ki67 (barre d’échelle = 20 μm). Le rouge signifie Ki67 et le vert signifie Olig2. Les images ont été capturées à l’aide d’un système de microscopie confocale avec des lignes laser de 488 nm et 594 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Troubles de la mémoire spatiale induits par l’injection de LPC. (A) Images représentatives du parcours de nage des souris dans chaque groupe en présence de la plateforme (phase d’apprentissage). (B) Images représentatives des trajectoires de nage des souris dans chaque groupe après avoir retiré la plate-forme (phase de mémoire). Le nombre d’animaux usagés est indiqué dans le tableau 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Groupe | Feinte | Groupe LPC |
| Coloration LFB | 6 | 12 (10 dpi, 6; 28 dpi, 6) |
| Microscopie électronique | 4 | 4 |
| Si | 6 | 6 |
| Transfert Western | 4 | 4 |
| Labyrinthe d’eau de Morrris | 12 | 12 |
Tableau 1 : Nombre d’animaux utilisés pour les différents tests.
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Discussion
La SEP, une maladie démyélinisante chronique du SNC, est l’une des causes les plus fréquentes de dysfonctionnement neurologique chez les jeunes adultesde 20 ans. Cliniquement, environ 60 % à 80 % des patients atteints de SEP connaissent le cycle de rechutes et de rémissions avant de développer une SEP progressive secondaire21,22, et cela conduit finalement à des troubles cumulatifs du mouvement et des déficits cognitifs au fil du temps23. Actuellement, aucun modèle expérimental ne couvre toute la variété des caractéristiques cliniques, pathologiques ou immunologiques de la maladie24. Pour simuler le processus pathologique et la pathogenèse de la SEP à différents stades, il existe trois modèles animaux démyélinisants courants avec leurs avantages et leurs limites, y compris le modèle EAE, les animaux d’alimentation CPZ et les modèles de démyélinisation induite par LPC.
Chez la souris, l’EAE est induite par une réponse immunitaire après l’injection d’antigènes de myéline, entraînant une activation microgliale et une infiltration des lymphocytes T et B périvasculaires, et les dommages à la myéline qui l’accompagnent sont souvent associés à la récurrence de la maladie20,25. Il simule mieux les caractéristiques de la période de rémission de la SEP. Cependant, il a également plusieurs limites. Par exemple, l’EAE est principalement une maladie affectant la substance blanche de la moelle épinière, tandis que la SEP provoque principalement la démyélinisation du cortex cérébral, et l’emplacement et le moment des lésions sont aléatoires, ce qui rend difficile l’obtention de lésions avec précision19.
CpZ et LPC sont les substances les plus couramment utilisées pour induire des modèles toxiques-démyélinisants. Ils sont tous capables de provoquer la démyélinisation du SNC après administration. Dans le modèle CPZ, l’alimentation de jeunes souris avec le chélateur de cuivre cuprizone a entraîné la mort des oligodendrocytes et une démyélinisation réversible ultérieure. Après le retrait de cuprizone, un processus de remyélinisation spontané a été déclenché dans les 4 jours26,27. CpZ entraîne principalement une démyélinisation étendue, tandis que l’injection de LPC incline vers la démyélinisation focale. En raison de la toxine et de la réponse inflammatoire, l’injection classique en un point de LPC déclenche une forme rapide et hautement reproductible de démyélinisation28.
Cependant, aucun des modèles ci-dessus ne peut imiter correctement le processus pathologique de sep progressive caractérisé par une démyélinisation persistante. Par conséquent, le présent protocole propose un modèle pour une injection en deux points de LPC directement dans le corps calleux afin d’induire une démyélinisation à long terme. Les étapes critiques du protocole comprennent le réglage horizontal de la tête de l’animal et la localisation des coordonnées d’injection. À l’étape 3.5., il faut s’assurer d’ajuster d’abord le niveau de la fontanelle bregma et postérieure, puis ajuster les niveaux gauche et droit. Dans le même temps, il convient de noter qu’après ajustement des niveaux gauche et droit, le point zéro doit être repositionné avant les opérations ultérieures. Cette étape est cruciale car elle est directement liée à la précision du positionnement. À l’étape 3.6., lors de la détermination des coordonnées de l’axe Z, il faut s’assurer que l’extrémité de l’aiguille et le crâne restent en contact exact, et le chercheur peut observer si l’aiguille est pliée. À l’étape 3.10., l’aiguille reste en place pendant 10 minutes pour empêcher le médicament de s’écouler hors du passage de l’aiguille.
Le protocole actuel comporte certaines limites. Comme d’autres modèles de démyélinisation induits par la toxicité, il manque la modélisation des processus immunologiques. Deuxièmement, bien que le modèle d’injection en deux points puisse maintenir la démyélinisation pendant une période relativement longue, elle s’accompagne inévitablement d’un léger degré de régénération de la myéline à mesure que la maladie progresse à un stade ultérieur. Il ne s’agit peut-être pas d’un modèle plus approprié pour simuler la sclérose en plaques progressive secondaire que l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale induite par la glycoprotéine oligodendrocytes de myéline (MOG)29,30. Le modèle classique d’injection de LPC en un point ne produit qu’une démyélinisation inflammatoire localisée accompagnée d’une remyélinisation spontanée. Des recherches antérieures ont montré que l’infiltration de lymphocytes T, de lymphocytes B et de macrophages après l’injection de LPC est un facteur clé dans la réparation de lamyéline 15. Cependant, par rapport au modèle d’injection classique, le modèle LPC à injection en deux points induit une démyélinisation focale rapide du corps calleux et maintient le degré de démyélinisation pendant une période plus longue avec peu de remyélinisation.
En raison de la complexité de la SP, les différents stades de la maladie nécessitent une meilleure description de différents modèles. L’injection en deux points de LPC via un cadre stéréotaxique est un modèle de souris expérimental stable, efficace et reproductible. Ce modèle peut conduire à une démyélinisation à long terme, accompagnée d’une réparation moindre de la myéline au fil du temps. Cela signifie que le modèle d’injection en deux points peut être utilisé non seulement pour étudier les maladies de démyélinisation, mais aussi pour étudier les interventions de réparation de la myéline. En outre, ce modèle peut facilement et rapidement évaluer la démyélinisation après l’intervention par immunofluorescence et méthodes histologiques, et le dysfonctionnement cognitif de la SEP peut être reflété par la mémoire spatiale altérée des souris démyélinisées dans le test comportemental. En conclusion, ce modèle de démyélinisation stable pourrait faciliter les études pathologiques et précliniques tant sur la progression secondaire de la SEP que sur la SEP récurrente-rémittente.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (Subventions: 82071380, 81873743).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
References
- Gaire, B. P., Choi, J. W. Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864 (2021).
- Compston, A., Coles, A.
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Mahad, D. H., Trapp, B. D., Lassmann, H. Pathological mechanisms in progressive multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 14 (2), 183-193 (2015).
- Filippi, M., et al.
- Villoslada, P., Steinman, L. New targets and therapeutics for neuroprotection, remyelination and repair in multiple sclerosis. Expert Opinion on Investigational Drugs. 29 (5), 443-459 (2020).
- Lassmann, H.
- Franklin, R. J., Ffrench-Constant, C. Remyelination in the CNS: From biology to therapy. Nature Reviews Neuroscience. 9 (11), 839-855 (2008).
- Gentile, A., et al. Immunomodulatory effects of exercise in experimental multiple sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2197 (2019).
- Chen, M., et al. Deficiency of microglial Hv1 channel is associated with activation of autophagic pathway and ROS production in LPC-induced demyelination mouse model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 333 (2020).
- Luo, Q., et al. A stable and easily reproducible model of focal white matter demyelination. Journal of Neuroscience Methods. 307, 230-239 (2018).
- Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination in experimental models of toxin-induced demyelination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 318, 193-212 (2008).
- Degaonkar, M. N., Raghunathan, P., Jayasundar, R., Jagannathan, N. R. Determination of relaxation characteristics during preacute stage of lysophosphatidyl choline-induced demyelinating lesion in rat brain: An animal model of multiple sclerosis. Magnetic Resonance Imaging. 23 (1), 69-73 (2005).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Plemel, J. R., et al. Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy. Glia. 66 (2), 327-347 (2018).
- Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Developmental Biology. 302 (2), 683-693 (2007).
- Kassis, H., et al. Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke. Neurochemistry International. 77, 17-23 (2014).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, Pt 8 1972-1983 (2006).
- Karussis, D. The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review. Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).
- Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45 (2022).
- Kutzelnigg, A., et al. Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis. Brain. 128, Pt 11 2705-2712 (2005).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality). Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).
- Lamport, A. C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum. Journal of Neuroimmunology. 334, 576995 (2019).
- Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. The cuprizone model for demyelination. Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum. 188, 72-76 (2008).
- Zhan, J., et al. The cuprizone model: Dos and do nots. Cells. 9 (4), 843 (2020).
- Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia (Barcelona, Spain). 35 (1), 32-39 (2020).
- Merkler, D., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset reflects the immunopathology of pattern II multiple sclerosis lesions. Multiple Sclerosis Journal. 12 (4), 369-374 (2006).
- Ucal, M., et al. Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats. Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).
