التصوير الحي لديناميات الأنابيب الدقيقة في خلايا الورم الأرومي الدبقي التي تغزو دماغ الزرد
Summary
أبلغنا عن تقنية تسمح بالتصوير الحي لديناميكيات الأنابيب الدقيقة في خلايا الورم الأرومي الدبقي (GBM) التي تغزو أنسجة المخ الفقارية. يسمح اقتران الحقن التقويمي لخلايا GBM الموسومة بالفلورسنت في دماغ الزرد الشفاف مع التصوير الداخلي عالي الدقة بقياس ديناميكيات الهيكل الخلوي أثناء غزو السرطان في الموقع .
Abstract
مع متوسط وقت البقاء على قيد الحياة الكئيب في السكان الحقيقيين – ما بين 6 إلى 15 شهرا – الورم الأرومي الدبقي (GBM) هو ورم الدماغ الخبيث الأكثر تدميرا. يرجع فشل العلاج بشكل أساسي إلى غزو خلايا GBM ، مما يدل على الحاجة إلى فهم أفضل لخصائص GBM المتحركة. للتحقيق في الآلية الجزيئية التي تدعم غزو GBM ، هناك حاجة إلى نماذج فسيولوجية جديدة تتيح توصيفا متعمقا لديناميكيات البروتين أثناء الغزو. هذه الملاحظات من شأنها أن تمهد الطريق لاكتشاف أهداف جديدة لمنع تسلل الورم وتحسين نتائج المرضى. تشير هذه الورقة إلى كيفية السماح للطعم الخارجي التقويمي لخلايا GBM في دماغ الزرد بالتصوير الحي داخل الخلايا تحت الخلوية. بالتركيز على الأنابيب الدقيقة (MTs) ، نصف إجراء لوضع العلامات على MT في خلايا GBM ، والحقن الدقيق لخلايا GBM في الدماغ الشفاف لمدة 3 أيام بعد الإخصاب (dpf) يرقات الزرد ، والتصوير داخل الجسم ل MTs في نشر الطعوم الأجنبية ، وتغيير ديناميكيات MT لتقييم دورها أثناء غزو GBM ، وتحليل البيانات المكتسبة.
Introduction
حركة الخلية هي عملية نمطية تتطلب إنشاء محور قطبية وإعادة ترتيب الهيكل الخلوي المولدة للقوة. تعرف بلمرة الأكتين وارتباطها بالميوسين بأنهما المساهمان الرئيسيان في القوى البارزة والانقباضية اللازمة لحركة الخلية1. تعتبر الأنابيب الدقيقة هي الجهات الفاعلة الرئيسية في استقطاب الخلايا وثبات الاتجاه أثناء الهجرة2. في السنوات الأخيرة ، ثبت أيضا أن MTs تخلق وتثبت نتوءات لدعم قوى الضغط الميكانيكي أثناء غزو الخلايا في 3D3. في الآونة الأخيرة ، شاركت MTs بشكل مباشر في النقل الميكانيكي في الالتصاقات البؤرية والهجرة الحساسة للميكانيكا4. يتكون عدم الاستقرار الديناميكي الذي يميز ديناميكيات نهاية MT-plus من مراحل متكررة من البلمرة (النمو) وإزالة البلمرة (الانكماش) ، والتي يتم التحكم فيها بواسطة عدد كبير من البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة وشلالات الإشارات داخل الخلايا ، مثل تلك التي يحكمها RHO-GTPases5،6،7. جعل دور شبكة MT في هجرة الخلايا وغزوها التحقيق في ديناميكيات MT عنصرا أساسيا لفهم آليات توجيه الخلايا المناعية والتئام الجروح وغزو السرطان بشكل أفضل.
تعد قدرة الخلايا السرطانية على الهروب من قلب الورم الرئيسي ، والانتشار في الأنسجة ، وتوليد أورام ثانوية خطوة حاسمة في منع النجاح العالمي في الحرب ضد السرطان التي أعلنت قبل 50 عاما 8,9. كانت إحدى أكبر العقبات هي فهم كيفية غزو الخلايا السرطانية للأنسجة بنشاط. تعتمد آليات الغزو الرئيسية على نفس المبادئ التي تحكم هجرة الخلايا غير السرطانية10. ومع ذلك ، ظهرت خصائص هجرة الخلايا السرطانية11 ، مما أثار الحاجة إلى توصيف أفضل لهذا النوع من الهجرة. على وجه التحديد ، نظرا لأن البيئة المكروية للورم تظهر كلاعب رئيسي في تطور السرطان12 ، فإن مراقبة وتحليل غزو الخلايا السرطانية في سياق فسيولوجي ذي صلة أمر ضروري لكشف آليات نشر الخلايا السرطانية.
تعتبر MTs أساسية لتطور السرطان ، للحفاظ على كل من الانتشار والغزو. يمكن أن يساعد التحليل الدقيق لديناميكيات MT في الموقع في تحديد عوامل تغيير MT (MTA) في كلتا العمليتين. تختلف ديناميكيات MT بشكل كبير عند حدوث تغيير في البيئة. في المختبر ، يمنع العلاج بعوامل مزعزعة للاستقرار MT مثل نوكودازول تكوين نتوء الخلايا عندما يتم تضمين الخلايا في المواد الهلامية في 3D ، في حين أنه ليس له تأثير يذكر على هجرة الخلايا ثنائية الأبعاد13,14. على الرغم من التحدي الفني ، إلا أن التقدم في التصوير داخل الجسم يسمح بتحليل ديناميكيات MT أثناء غزو الخلايا السرطانية في الجسم الحي. على سبيل المثال ، كشفت ملاحظة MTs في خلايا الساركوما الليفية المطعمة تحت الجلد في الفئران أن الضامة المرتبطة بالورم تؤثر على ديناميكيات MT في الخلايا السرطانية15. ومع ذلك ، فإن نماذج الفئران هذه تنطوي على إجراءات جراحية واسعة النطاق وتظل غير مرضية للسرطانات التي يصعب الوصول إليها ، مثل ورم الدماغ شديد التوغل ، GBM.
على الرغم من متوسط وقت البقاء على قيد الحياة الكئيب لمدة 15 شهرا16 ، لا يعرف سوى القليل عن طريقة انتشار GBM داخل حمة الدماغ أو العناصر الجزيئية الرئيسية التي تدعم غزو خلايا GBM في أنسجة المخ. قدم التحسين في نموذج xenograft التقويمي للفأر (PDX) وإنشاء نوافذ الجمجمة آفاقا جديدة لدراسات غزو خلايا GBM17,18. ومع ذلك ، نظرا لجودة التصوير دون المستوى الأمثل ، فقد سمح هذا النموذج في الغالب بالتصوير الطولي للطعوم الخارجية السطحية ولم يتم استخدامه بنجاح لدراسة التصوير تحت الخلوي لبروتينات الهيكل الخلوي حتى الآن. علاوة على ذلك ، في أعقاب الأمر القضائي “3Rs” للحد من استخدام القوارض واستبدالها بالفقاريات السفلية ، تم إنشاء نماذج بديلة.
الاستفادة من المناعة البدائية التي لوحظت في يرقات الزرد (Danio rerio) ، تم تطوير الحقن التقويمي لخلايا GBM في دماغ الأسماك19،20،21. الحقن بالقرب من البطينين في الدماغ المتوسط النامي يلخص معظم الفيزيولوجيا المرضية GBM البشرية21 ، ويلاحظ نفس النمط المفضل لغزو GBM كما هو الحال في خيار الأوعية البشرية22. بفضل شفافية يرقات الأسماك ، يسمح هذا النموذج بتصور خلايا GBM التي تغزو الدماغ من المناطق المحيطة بالبطين حيث يعتقد أن معظم GBMs تنشأ23.
نظرا لأن MTs ضرورية لغزو خلايا GBM في المختبر24,25 ، فهناك حاجة إلى توصيف أفضل لديناميكيات MT وتحديد المنظمين الرئيسيين أثناء غزو الخلايا. ومع ذلك ، حتى الآن ، لم تتضمن البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام نموذج تقويم الزرد تحليلا تحت خلوي لديناميكيات MT أثناء عملية الغزو. تقدم هذه الورقة بروتوكولا لدراسة ديناميكيات MT في الجسم الحي وتحديد دورها أثناء غزو سرطان الدماغ. بعد وضع علامات على الأنابيب الدقيقة المستقرة ، يتم حقن خلايا GBM الدقيقة عند 3 dpf في أدمغة يرقات الزرد وتصويرها في الوقت الفعلي بدقة مكانية وزمانية عالية أثناء تقدمها في أنسجة المخ. يسمح التصوير المباشر ل MTs الفلوري بالتحليل النوعي والكمي لديناميكيات MT plus-end. علاوة على ذلك ، يتيح هذا النموذج تقييم تأثير MTAs على ديناميكيات MT وعلى الخصائص الغازية لخلايا GBM في الوقت الفعلي. هذا البروتوكول غير الجراحي نسبيا جنبا إلى جنب مع عدد كبير من اليرقات التي يتم التعامل معها في وقت واحد وسهولة تطبيق الدواء (في مياه السمك) يجعل النموذج أحد الأصول للاختبار قبل السريري.
Protocol
Representative Results
Discussion
من المرجح أن يصبح تصوير الطعوم الخارجية للورم بدقة خلية واحدة أداة لا غنى عنها لتحسين فهمنا لبيولوجيا GBM. أدى التصوير المباشر في نماذج PDX للفأر إلى اكتشافات قيمة حول كيفية غزو GBM بشكل جماعي لأنسجة المخ18. ومع ذلك ، حتى الآن ، فإن الدقة الزمانية المكانية ليست عالية بما يكفي للكشف ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون للغاية للدكتور ب. هيربوميل (معهد باستور ، فرنسا) ومختبره ، وخاصة فاليري بريولات ، وإيما كولوتشي جويون لتزويدنا بخطوط الزرد والعفن البلاستيكي لألواح الحقن المجهري ، ولخبرتهم القيمة في الإجراءات التجريبية لسمك الزرد. نحن نعرب عن امتناننا ل UtechS Photonic BioImaging (C2RT ، معهد باستور ، بدعم من وكالة البحوث الوطنية الفرنسية France BioImimaging ، و ANR-10-INBS-04; استثمارات للمستقبل). تم دعم هذا العمل من قبل الرابطة لمكافحة السرطان (EL2017. LNCC) ، والمركز الوطني للبحوث العلمية ، ومعهد باستور وبالتبرعات السخية للسيدة مارغريت ميشيل والسيد بوركيه.
Materials
| Glioblastoma cell culture | |||
| Foetal calf serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | Reagent |
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | Reagent |
| Modified Eagle's medium | Eurobio | CM1MEM18-01 | Reagent |
| Penicillin–streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| U-87 MG | ECACC | 89081402-1VL | Cells |
| Lenitivirus production | |||
| BD FACSAria III | BD bioscience | Instrument | |
| BD FACSDiva software v8.0 | BD bioscience | Software | |
| HEK-293T | Merck | 12022001 | Cells |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | Reagent |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | Reagent |
| Ultracentrifuge Optima XPN-80 | Beckman Coulter | Instrument | |
| Cell passaging and staining | |||
| dPBS | Gibco | 14190-094 | Chemical |
| Hoechst 34580 | Sigma-Aldrich | 63493 | Chemical |
| Trypsin-EDTA (0,05%) | Gibco | 25300-054 | Reagent |
| Zebrafish husbandry | |||
| Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC | LEICA | https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ | Instrument |
| Methylene Blue hydrate | Sigma-Aldrich | M4159 | Chemical |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-25G | Chemical |
| Transfer Pipettes fine tips | Samco Scientific | 232 | Equipment |
| Transfer Pipettes Large Bulb3mL | Samco Scientific | 225 | Equipment |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | Cat#: A5040 | Chemical |
| Volvic Source Water | DUTSCHER DOMINIQUE SAS | 999556 | Reagent |
| Xenotransplantation | |||
| 24-well plate | TPP | 92024 | Equipment |
| Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) | Harvard Apparatus | (#30-0017 GC100-15 | Equipment |
| CellTram oil vario microinjector | Eppendorf | 5176000.025 | Instrument |
| Microloading pipet tips (Microloader) 20µL | Eppendorf | 5242956003 | Equipment |
| Micromanipulator | NARISHIGE | https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html | Equipment |
| Mineral Oil | Sigma | M8410-100ml | Equipment |
| Stereomicroscope | Olympus | KL 2500 LCD | Instrument |
| Universal capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | Equipment |
| Vertical Pipette puller | KOPF (Roucaire) | Model 720 | Instrument |
| Intravital Imaging | |||
| 3.5cm glass-bottom videoimaging dish | MatTek Life Sciences, MA, USA | P35G-1,5-14-C | Equipment |
| Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 | Nikon | Software | |
| Heat-Block | Techne | DRI-BLOCK DB-2D | Equipment |
| Microscope head Nikon Ti2E | Nikon | Instrument | |
| sCMOS camera Prime 95B | Photometrics | Instrument | |
| sCMOS camera Orca Flash 4 | Hammatsu | Instrument | |
| Ultrapure Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | Chemical |
| Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit | Hammatsu | Instrument | |
| Drug Treatment | |||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Chemical |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG | Chemical |
| Image Analysis | |||
| Imaris 9.5.1 software | Oxford Instruments | Software | |
| ImarisFileConverter 9.5.1 | Oxford Instruments | Software |
Riferimenti
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Etienne-Manneville, S. Microtubules in cell migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 471-499 (2013).
- Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
- Seetharaman, S., et al. Microtubules tune mechanosensitive cell responses. Nature Materials. 21 (3), 366-377 (2022).
- Etienne-Manneville, S. From signaling pathways to microtubule dynamics: the key players. Current Opinion in Cell Biology. 22 (1), 104-111 (2010).
- Garcin, C., Straube, A. Microtubules in cell migration. Essays in Biochemistry. 63 (5), 509-520 (2019).
- Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
- Nature editorial. The ‘war on cancer’ isn’t yet won. Nature. 601 (297), (2022).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
- Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
- Meyer, A. S., et al. 2D protrusion but not motility predicts growth factor-induced cancer cell migration in 3D collagen. Journal of Cell Biology. 197 (6), 721-729 (2012).
- Bouchet, B. P., et al. Mesenchymal cell invasion requires cooperative regulation of persistent microtubule growth by SLAIN2 and CLASP1. Developmental Cell. 39 (6), 708-723 (2016).
- Luthria, G., et al. In vivo microscopy reveals macrophage polarization locally promotes coherent microtubule dynamics in migrating cancer cells. Nature Commun. 11 (1), 3521 (2020).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
- Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (86), e55108 (2014).
- Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
- Astell, K. R., Sieger, D. Investigating microglia-brain tumor cell interactions in vivo in the larval zebrafish brain. Methods in Cell Biology. , 593-626 (2017).
- Zeng, A., et al. Identify a blood-brain barrier penetrating drug-TNB using zebrafish orthotopic glioblastoma xenograft model. Scientific Reports. 7 (1), 14372 (2017).
- Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Disease Models & Mechanisms. 9 (9), 1063-1065 (2016).
- Umans, R. A., Ten Kate, M., Pollock, C., Sontheimer, H. Fishing for contact: modeling perivascular glioma invasion in the zebrafish brain. ACS Pharmacology & Translational Science. 4 (4), 1295-1305 (2021).
- Lee, J. H., et al. Human glioblastoma arises from subventricular zone cells with low-level driver mutations. Nature. 560 (7717), 243-247 (2018).
- Pagano, A., et al. Epothilone B inhibits migration of glioblastoma cells by inducing microtubule catastrophes and affecting EB1 accumulation at microtubule plus ends. Biochemical Pharmacology. 84 (4), 432-443 (2012).
- Berges, R., et al. The novel tubulin-binding checkpoint activator BAL101553 inhibits EB1-dependent migration and invasion and promotes differentiation of glioblastoma stem-like cells. Molecular Cancer Therapeutics. 15 (11), 2740-2749 (2016).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Volvic source water mineral composition. Volvic Available from: https://www.volvic.co.uk/volcanic-water/composition (2022)
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). The University of Oregon Press, Eugene. , (2000).
- E3, M. . Recipe E3 medium (for zebrafish embryos. , (2011).
- Straube, A. How to measure microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 777, 1-14 (2011).
- Honore, S., Braguer, D. Investigating microtubule dynamic instability using microtubule-targeting agents. Methods in Molecular Biology. 777, 245-260 (2011).
- Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles. Journal of Visualized Experiments. (153), e60478 (2019).
- Serikbaeva, A., Tvorogova, A., Kauanova, S., Vorobjev, I. A. Analysis of microtubule dynamics heterogeneity in cell culture. Methods in Molecular Biology. 1745, 181-204 (2018).
- Schnurr, M. E., Yin, Y., Scott, G. R. Temperature during embryonic development has persistent effects on metabolic enzymes in the muscle of zebrafish. Journal of Experimental Biology. 217 (8), 1370-1380 (2014).
- Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
- Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
- Wu, J. S., et al. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Translational Oncology. 14 (1), 100899 (2021).
- Hamilton, L., Astell, K. R., Velikova, G., Sieger, D. A zebrafish live imaging model reveals differential responses of microglia toward glioblastoma cells in vivo. Zebrafish. 13 (6), 523-534 (2016).
- Gillespie, S., Monje, M. An active role for neurons in glioma progression: making sense of Scherer’s structures. NeuroOncology. 20 (10), 1292-1299 (2018).
- Wolf, K. J., et al. A mode of cell adhesion and migration facilitated by CD44-dependent microtentacles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11432-11443 (2020).
- Zhou, Y. X., et al. Transcriptional upregulation of microtubule-associated protein 2 is involved in the protein kinase A-induced decrease in the invasiveness of glioma cells. Neuro-Oncology. 17 (12), 1578-1588 (2015).
- Monzo, P., et al. Mechanical confinement triggers glioma linear migration dependent on formin FHOD3. Molecular Biology of the Cell. 27 (8), 1246-1261 (2016).
- Vollmann-Zwerenz, A., Leidgens, V., Feliciello, G., Klein, C. A., Hau, P. Tumor cell invasion in glioblastoma. International Journal of Molecular Science. 21 (6), 1932 (2020).
- Feng, H., et al. EGFRvIII stimulates glioma growth and invasion through PKA-dependent serine phosphorylation of Dock180. Oncogene. 33 (19), 2504-2512 (2014).
- Liu, R., et al. Cdk5-mediated regulation of the PIKE-A-Akt pathway and glioblastoma cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (21), 7570-7575 (2008).
- Xiao, J., Glasgow, E., Agarwal, S. Zebrafish xenografts for drug discovery and personalized medicine. Trends in Cancer. 6 (7), 569-579 (2020).
- Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. The power of zebrafish in personalised medicine. Personalised Medicine: Lessons from Neurodegeneration to Cancer. 1007, 179-197 (2017).
- Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
- Stanchi, F., Matsumoto, K., Gerhardt, H. Imaging glioma progression by intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 1862, 227-243 (2019).
