JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Live imaging van microtubulidynamica in glioblastoomcellen die het zebravisbrein binnendringen

Published: July 29, 2022
doi:
10.3791/64093
, ,
1Cell Polarity, Migration and Cancer Unit,Université Paris-Cité, Institut Pasteur, Équipe Labellisée Ligue Contre le Cancer

Summary

We rapporteren een techniek die live beeldvorming mogelijk maakt van microtubule dynamica in glioblastoom (GBM) cellen die een gewerveld hersenweefsel binnendringen. Door de orthotopische injectie van fluorescerend gelabelde GBM-cellen te koppelen aan een transparant zebravisbrein met intravitale beeldvorming met hoge resolutie, kan de cytoskeletdynamiek worden gemeten tijdens in situ kankerinvasie.

Abstract

Met een sombere mediane overlevingstijd in echte populaties – tussen 6 en 15 maanden – is glioblastoom (GBM) de meest verwoestende kwaadaardige hersentumor. Falen van de behandeling is voornamelijk te wijten aan de invasiviteit van GBM-cellen, wat spreekt voor de behoefte aan een beter begrip van GBM-beweeglijke eigenschappen. Om het moleculaire mechanisme ter ondersteuning van GBM-invasie te onderzoeken, zijn nieuwe fysiologische modellen nodig die een diepgaande karakterisering van eiwitdynamiek tijdens de invasie mogelijk maken. Deze observaties zouden de weg vrijmaken voor de ontdekking van nieuwe doelen om tumorinfiltratie te blokkeren en de resultaten voor patiënten te verbeteren. Dit artikel meldt hoe een orthotopisch xenograft van GBM-cellen in de hersenen van zebravissen subcellulaire intravitale live beeldvorming mogelijk maakt. Gericht op microtubuli (MT’s), beschrijven we een procedure voor MT-etikettering in GBM-cellen, micro-injectie van GBM-cellen in de transparante hersenen van 3 dagen na bevruchting (dpf) zebravislarven, intravitale beeldvorming van MT’s in de verspreidende xenografts, het veranderen van MT-dynamiek om hun rol tijdens GBM-invasie te beoordelen en het analyseren van de verkregen gegevens.

Introduction

Celmotiliteit is een stereotiep proces dat polariteitsasvorming en krachtgenererende cytoskeletale herschikkingen vereist. Actinepolymerisatie en de associatie met myosine worden erkend als de belangrijkste bijdragen aan uitsteek- en contractiele krachten die nodig zijn voor celbeweging1. Microtubuli worden beschouwd als de belangrijkste actoren in celpolarisatie en directionele persistentie tijdens migratie2. In de afgelopen jaren is ook aangetoond dat MT’s uitsteeksels creëren en stabiliseren om mechanocompressieve krachten te ondersteunen tijdens celinvasie in 3D3. Meer recent zijn MT’s direct betrokken geweest bij mechanotransductie bij focale verklevingen en mechanosensitive migration4. De dynamische instabiliteit die MT-plus einddynamica kenmerkt, bestaat uit herhaalde fasen van polymerisatie (groei) en depolymerisatie (krimp), die worden gecontroleerd door een overvloed aan microtubule-bindende eiwitten en intracellulaire signaleringscascades, zoals die worden geregeld door RHO-GTPases 5,6,7. De rol van het MT-netwerk in celmigratie en invasie heeft het onderzoek naar MT-dynamiek tot een belangrijk element gemaakt om de mechanismen van immuuncel homing, wondgenezing en kankerinvasie beter te begrijpen.

Het vermogen van kankercellen om te ontsnappen aan de primaire tumorkern, zich te verspreiden in de weefsels en secundaire tumoren te genereren, is een cruciale stap in het voorkomen van wereldwijd succes in de oorlog tegen kanker die 50 jaar geleden 8,9 werd verklaard. Een van de grootste obstakels is het begrijpen hoe kankercellen actief het weefsel binnendringen. Belangrijke invasiemechanismen vertrouwen op dezelfde principes als die voor niet-tumorachtige celmigratie10. Er zijn echter specifieke kenmerken van kankercelmigratie naar vorengekomen 11, waardoor de behoefte aan een betere karakterisering van dit type migratie is ontstaan. In het bijzonder, omdat de tumormicro-omgeving verschijnt als een belangrijke speler in kankerprogressie12, is het observeren en analyseren van kankercelinvasie in een relevante fysiologische context essentieel om de mechanismen van kankercelverspreiding te ontrafelen.

MT’s staan centraal in de progressie van kanker, om zowel proliferatie als invasie in stand te houden. Nauwkeurige analyse van MT-dynamica in situ kan helpen bij het identificeren van MT-veranderende agentia (MTA) in beide processen. MT-dynamiek varieert drastisch bij een verandering in de omgeving. In vitro voorkomt behandeling met MT-destabiliserende middelen zoals nocodazol de vorming van celuitsteeksels wanneer cellen zijn ingebed in gels in 3D, terwijl het weinig effect heeft op 2D-celmigratie13,14. Hoewel technisch uitdagend, maakt vooruitgang in intravitale beeldvorming in vivo analyse van MT-dynamiek tijdens invasie van kankercellen mogelijk. De observatie van MT’s in subcutaan xenogetransplanteerde fibrosarcoomcellen bij muizen onthulde bijvoorbeeld dat tumor-geassocieerde macrofagen de MT-dynamiek in tumorcellen beïnvloeden15. Deze muismodellen omvatten echter uitgebreide chirurgische procedures en blijven onbevredigend voor minder toegankelijke kankers, zoals de zeer invasieve hersentumor GBM.

Ondanks een sombere gemiddelde overlevingstijd van15 maanden 16, is er weinig bekend over de verspreidingswijze van GBM in het hersenparenchym of de belangrijkste moleculaire elementen die GBM-celinvasie in het hersenweefsel ondersteunen. Verbetering van het muis orthotopisch xenograft (PDX) model en de oprichting van schedelvensters boden nieuwe perspectieven voor GBM celinvasiestudies17,18. Vanwege de suboptimale beeldvormingskwaliteit heeft dit model echter meestal longitudinale beeldvorming van oppervlakkige xenografts mogelijk gemaakt en is het tot nu toe niet met succes gebruikt om subcellulaire beeldvorming van cytoskeleteiwitten te bestuderen. Bovendien zijn in de nasleep van het “3Rs” -bevel om het gebruik van knaagdieren te verminderen en te vervangen door lagere gewervelde dieren, alternatieve modellen opgesteld.

Gebruikmakend van de primitieve immuniteit waargenomen bij zebravis (Danio rerio) larven, werd orthotopische injectie van GBM-cellen in het visbrein ontwikkeld 19,20,21. Injectie in de buurt van de ventrikels in de zich ontwikkelende middenhersenenvatvatting het grootste deel van de menselijke GBM-pathofysiologie21, en hetzelfde voorkeurspatroon van GBM-invasie als bij menselijke co-optie wordt waargenomen22. Dankzij de transparantie van de vislarven maakt dit model de visualisatie mogelijk van GBM-cellen die de hersenen binnendringen vanuit de peri-ventriculaire gebieden waar de meeste GBM’s worden verondersteld te ontstaan23.

Omdat MT’s essentieel zijn voor GBM-celinvasie in vitro24,25, is een betere karakterisering van MT-dynamica en de identificatie van belangrijke regulatoren tijdens celinvasie nodig. Tot op heden hebben de gegevens die zijn gegenereerd met het orthotopische model van zebravissen echter geen subcellulaire analyse van MT-dynamiek tijdens het invasieproces opgenomen. Dit artikel biedt een protocol om MT-dynamiek in vivo te bestuderen en de rol ervan tijdens de invasie van hersenkanker te bepalen. Na stabiele microtubule-etikettering worden GBM-cellen micro geïnjecteerd met 3 dpf in de hersenen van zebravislarven en in realtime in beeld gebracht met een hoge spatio-temporele resolutie tijdens hun progressie in het hersenweefsel. Live beeldvorming van fluorescerende MT’s maakt de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van MT plus-end dynamica mogelijk. Bovendien maakt dit model het mogelijk om het effect van MTA’s op MT-dynamica en op de invasieve eigenschappen van GBM-cellen in realtime te beoordelen. Dit relatief niet-invasieve protocol in combinatie met een groot aantal larven dat tegelijkertijd wordt behandeld en het gemak van medicijntoepassing (in het viswater) maakt het model een aanwinst voor preklinisch testen.

Protocol

Dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Europese Unie voor het omgaan met proefdieren. Alle protocollen zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Dierproeven van het Institut Pasteur – CEEA 89 en het Franse Ministerie van Onderzoek en Onderwijs (vergunning #01265.03). Tijdens injecties of live beeldvormingssessies werden dieren verdoofd met Tricaine.At het einde van de experimentele procedures werden ze geëuthanaseerd door een overdosis anestheticum. Zie de tabel met materialen</strong…

Representative Results

Om de rol van MT’s tijdens in vivo GBM-invasie te analyseren, beschrijven we hier de belangrijkste stappen om stabiele MT-etikettering in GBM-cellen uit te voeren door lentivirale infectie, orthotopische xenotransplantatie van GBM-cellen in 3 dpf zebravislarven, intravitale beeldvorming met hoge resolutie van MT-dynamiek, MTA-behandeling en de effecten ervan op GBM-invasie, en beeldanalyse van MT-dynamiek en in vivo invasie (figuur 1). MT-dynamiek wordt ge…

Discussion

Het in beeld brengen van tumor xenografts met eencellige resolutie zal waarschijnlijk een onmisbaar hulpmiddel worden om ons begrip van GBM-biologie te verbeteren. Live beeldvorming in PDX-modellen van muizen heeft geleid tot waardevolle ontdekkingen over hoe GBM collectief het hersenweefsel binnendringt18. Tot op heden is de spatiotemporale resolutie echter niet hoog genoeg om de dynamiek van eiwitten die de GBM-invasie beheersen te onthullen. We redeneerden dat door de orthotopische engrafting v…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zijn Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, Frankrijk) en zijn laboratorium, in het bijzonder Valérie Briolat, en Emma Colucci-Guyon zeer dankbaar voor het leveren van de zebravislijnen en de plastic mal voor micro-injectieplaten, en voor hun waardevolle expertise over experimentele procedures voor zebravissen. We bedanken dankbaar de UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, ondersteund door het Franse nationale onderzoeksbureau France BioImaging, en ANR-10-INBS-04; Investeringen voor de toekomst). Dit werk werd ondersteund door de Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), het Centre National de la Recherche Scientifique, en Institut Pasteur en door de gulle giften van mevrouw Marguerite MICHEL en de heer Porquet.

Materials

Glioblastoma cell culture
Foetal calf serum Eurobio CVFSVF00-01 Reagent
MEM NEAA Gibco 11140-050 Reagent
Modified Eagle's medium Eurobio CM1MEM18-01 Reagent
Penicillin–streptomycin Gibco 15140-122 Reagent
U-87 MG ECACC 89081402-1VL Cells
Lenitivirus production
BD FACSAria III BD bioscience Instrument
BD FACSDiva software v8.0 BD bioscience Software
HEK-293T Merck 12022001 Cells
pMD2.G Addgene Plasmid #12259 Reagent
psPAX2 Addgene Plasmid #12260 Reagent
Ultracentrifuge Optima XPN-80 Beckman Coulter Instrument
Cell passaging and staining
dPBS Gibco 14190-094 Chemical
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Chemical
Trypsin-EDTA (0,05%) Gibco 25300-054 Reagent
Zebrafish husbandry
Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC LEICA https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ Instrument
Methylene Blue hydrate Sigma-Aldrich M4159 Chemical
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629-25G Chemical
Transfer Pipettes fine tips Samco Scientific 232 Equipment
Transfer Pipettes Large Bulb3mL Samco Scientific 225 Equipment
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich Cat#: A5040 Chemical
Volvic Source Water DUTSCHER DOMINIQUE SAS 999556 Reagent
Xenotransplantation
24-well plate TPP 92024 Equipment
Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) Harvard Apparatus (#30-0017 GC100-15 Equipment
CellTram oil vario microinjector Eppendorf 5176000.025 Instrument
Microloading pipet tips (Microloader) 20µL Eppendorf  5242956003 Equipment
Micromanipulator NARISHIGE https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html Equipment
Mineral Oil Sigma M8410-100ml Equipment
Stereomicroscope Olympus KL 2500 LCD Instrument
Universal capillary holder Eppendorf 5176190002 Equipment
Vertical Pipette puller KOPF (Roucaire) Model 720 Instrument
Intravital Imaging
3.5cm glass-bottom videoimaging dish MatTek Life Sciences, MA, USA P35G-1,5-14-C Equipment
Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 Nikon Software
Heat-Block Techne DRI-BLOCK DB-2D Equipment
Microscope head Nikon Ti2E Nikon Instrument
sCMOS camera Prime 95B Photometrics Instrument
sCMOS camera Orca Flash 4 Hammatsu Instrument
Ultrapure Low melting point agarose Invitrogen 16520-050 Chemical
Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit Hammatsu Instrument
Drug Treatment
DMSO Sigma-Aldrich D2650-100ML Chemical
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404-2MG Chemical
Image Analysis
Imaris 9.5.1 software Oxford Instruments Software
ImarisFileConverter 9.5.1 Oxford Instruments Software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  2. Etienne-Manneville, S. Microtubules in cell migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 471-499 (2013).
  3. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  4. Seetharaman, S., et al. Microtubules tune mechanosensitive cell responses. Nature Materials. 21 (3), 366-377 (2022).
  5. Etienne-Manneville, S. From signaling pathways to microtubule dynamics: the key players. Current Opinion in Cell Biology. 22 (1), 104-111 (2010).
  6. Garcin, C., Straube, A. Microtubules in cell migration. Essays in Biochemistry. 63 (5), 509-520 (2019).
  7. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  8. Nature editorial. The ‘war on cancer’ isn’t yet won. Nature. 601 (297), (2022).
  9. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  10. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  11. Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
  12. Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
  13. Meyer, A. S., et al. 2D protrusion but not motility predicts growth factor-induced cancer cell migration in 3D collagen. Journal of Cell Biology. 197 (6), 721-729 (2012).
  14. Bouchet, B. P., et al. Mesenchymal cell invasion requires cooperative regulation of persistent microtubule growth by SLAIN2 and CLASP1. Developmental Cell. 39 (6), 708-723 (2016).
  15. Luthria, G., et al. In vivo microscopy reveals macrophage polarization locally promotes coherent microtubule dynamics in migrating cancer cells. Nature Commun. 11 (1), 3521 (2020).
  16. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
  17. Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (86), e55108 (2014).
  18. Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
  19. Astell, K. R., Sieger, D. Investigating microglia-brain tumor cell interactions in vivo in the larval zebrafish brain. Methods in Cell Biology. , 593-626 (2017).
  20. Zeng, A., et al. Identify a blood-brain barrier penetrating drug-TNB using zebrafish orthotopic glioblastoma xenograft model. Scientific Reports. 7 (1), 14372 (2017).
  21. Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Disease Models & Mechanisms. 9 (9), 1063-1065 (2016).
  22. Umans, R. A., Ten Kate, M., Pollock, C., Sontheimer, H. Fishing for contact: modeling perivascular glioma invasion in the zebrafish brain. ACS Pharmacology & Translational Science. 4 (4), 1295-1305 (2021).
  23. Lee, J. H., et al. Human glioblastoma arises from subventricular zone cells with low-level driver mutations. Nature. 560 (7717), 243-247 (2018).
  24. Pagano, A., et al. Epothilone B inhibits migration of glioblastoma cells by inducing microtubule catastrophes and affecting EB1 accumulation at microtubule plus ends. Biochemical Pharmacology. 84 (4), 432-443 (2012).
  25. Berges, R., et al. The novel tubulin-binding checkpoint activator BAL101553 inhibits EB1-dependent migration and invasion and promotes differentiation of glioblastoma stem-like cells. Molecular Cancer Therapeutics. 15 (11), 2740-2749 (2016).
  26. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  27. Volvic source water mineral composition. Volvic Available from: https://www.volvic.co.uk/volcanic-water/composition (2022)
  28. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  29. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). The University of Oregon Press, Eugene. , (2000).
  30. E3, M. . Recipe E3 medium (for zebrafish embryos. , (2011).
  31. Straube, A. How to measure microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 777, 1-14 (2011).
  32. Honore, S., Braguer, D. Investigating microtubule dynamic instability using microtubule-targeting agents. Methods in Molecular Biology. 777, 245-260 (2011).
  33. Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles. Journal of Visualized Experiments. (153), e60478 (2019).
  34. Serikbaeva, A., Tvorogova, A., Kauanova, S., Vorobjev, I. A. Analysis of microtubule dynamics heterogeneity in cell culture. Methods in Molecular Biology. 1745, 181-204 (2018).
  35. Schnurr, M. E., Yin, Y., Scott, G. R. Temperature during embryonic development has persistent effects on metabolic enzymes in the muscle of zebrafish. Journal of Experimental Biology. 217 (8), 1370-1380 (2014).
  36. Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
  37. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  38. Wu, J. S., et al. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Translational Oncology. 14 (1), 100899 (2021).
  39. Hamilton, L., Astell, K. R., Velikova, G., Sieger, D. A zebrafish live imaging model reveals differential responses of microglia toward glioblastoma cells in vivo. Zebrafish. 13 (6), 523-534 (2016).
  40. Gillespie, S., Monje, M. An active role for neurons in glioma progression: making sense of Scherer’s structures. NeuroOncology. 20 (10), 1292-1299 (2018).
  41. Wolf, K. J., et al. A mode of cell adhesion and migration facilitated by CD44-dependent microtentacles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11432-11443 (2020).
  42. Zhou, Y. X., et al. Transcriptional upregulation of microtubule-associated protein 2 is involved in the protein kinase A-induced decrease in the invasiveness of glioma cells. Neuro-Oncology. 17 (12), 1578-1588 (2015).
  43. Monzo, P., et al. Mechanical confinement triggers glioma linear migration dependent on formin FHOD3. Molecular Biology of the Cell. 27 (8), 1246-1261 (2016).
  44. Vollmann-Zwerenz, A., Leidgens, V., Feliciello, G., Klein, C. A., Hau, P. Tumor cell invasion in glioblastoma. International Journal of Molecular Science. 21 (6), 1932 (2020).
  45. Feng, H., et al. EGFRvIII stimulates glioma growth and invasion through PKA-dependent serine phosphorylation of Dock180. Oncogene. 33 (19), 2504-2512 (2014).
  46. Liu, R., et al. Cdk5-mediated regulation of the PIKE-A-Akt pathway and glioblastoma cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (21), 7570-7575 (2008).
  47. Xiao, J., Glasgow, E., Agarwal, S. Zebrafish xenografts for drug discovery and personalized medicine. Trends in Cancer. 6 (7), 569-579 (2020).
  48. Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. The power of zebrafish in personalised medicine. Personalised Medicine: Lessons from Neurodegeneration to Cancer. 1007, 179-197 (2017).
  49. Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
  50. Stanchi, F., Matsumoto, K., Gerhardt, H. Imaging glioma progression by intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 1862, 227-243 (2019).

Tags

Microtubule DynamicsGlioblastoma CellsZebrafish BrainSubcellular Intravital ImagingBrain Cancer InvasionProtein AnalysisCell TransplantationMicroinjectionAnesthetized Larvae
check_url/it/64093?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Peglion, F., Coumailleau, F., Etienne-Manneville, S. Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (185), e64093, doi:10.3791/64093 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image