Imagerie en direct de la dynamique des microtubules dans les cellules de glioblastome envahissant le cerveau du poisson zèbre
Summary
Nous rapportons une technique permettant l’imagerie en direct de la dynamique des microtubules dans les cellules de glioblastome (GBM) envahissant un tissu cérébral de vertébrés. Le couplage de l’injection orthotopique de cellules GBM marquées par fluorescence dans un cerveau de poisson-zèbre transparent avec une imagerie intravitale à haute résolution permet de mesurer la dynamique du cytosquelette lors de l’invasion in situ du cancer.
Abstract
Avec un temps de survie médian lamentable dans les populations réelles – entre 6 et 15 mois – le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale maligne la plus dévastatrice. L’échec du traitement est principalement dû au caractère invasif des cellules GBM, ce qui témoigne de la nécessité d’une meilleure compréhension des propriétés mobiles du GBM. Pour étudier le mécanisme moléculaire soutenant l’invasion du GBM, de nouveaux modèles physiologiques permettant une caractérisation approfondie de la dynamique des protéines pendant l’invasion sont nécessaires. Ces observations ouvriraient la voie à la découverte de nouvelles cibles pour bloquer l’infiltration tumorale et améliorer les résultats pour les patients. Cet article rapporte comment une xénogreffe orthotopique de cellules GBM dans le cerveau du poisson zèbre permet l’imagerie vivante intravitale subcellulaire. En nous concentrant sur les microtubules (MT), nous décrivons une procédure de marquage MT dans les cellules GBM, la microinjection de cellules GBM dans le cerveau transparent de larves de poisson zèbre 3 jours après la fécondation (dpf), l’imagerie intravitale des MT dans les xénogreffes disséminées, la modification de la dynamique MT pour évaluer leur rôle lors de l’invasion GBM et l’analyse des données acquises.
Introduction
La motilité cellulaire est un processus stéréotypé nécessitant l’établissement d’un axe de polarité et des réarrangements cytosquelettiques générateurs de force. La polymérisation de l’actine et son association avec la myosine sont reconnues comme les principaux contributeurs aux forces protrusives et contractiles nécessaires au mouvement cellulaire1. Les microtubules sont considérés comme les principaux acteurs de la polarisation cellulaire et de la persistance directionnelle pendant la migration2. Ces dernières années, il a également été démontré que les MT créent et stabilisent des protubérances pour soutenir les forces mécanocompressives lors de l’invasion cellulaire en 3D3. Plus récemment, les MT ont été directement impliquées dans la mécanotransduction aux adhérences focales et la migration mécanosensible4. L’instabilité dynamique qui caractérise la dynamique terminale MT-plus est constituée de phases répétées de polymérisation (croissance) et de dépolymérisation (retrait), qui sont contrôlées par une pléthore de protéines de liaison aux microtubules et de cascades de signalisation intracellulaires, telles que celles régies par les RHO-GTPases 5,6,7. Le rôle du réseau MT dans la migration et l’invasion cellulaire a fait de l’étude de la dynamique de la MT un élément clé pour mieux comprendre les mécanismes de la localisation des cellules immunitaires, de la cicatrisation des plaies et de l’invasion du cancer.
La capacité des cellules cancéreuses à s’échapper du noyau tumoral primaire, à se propager dans les tissus et à générer des tumeurs secondaires est une étape cruciale pour empêcher le succès mondial dans la guerre contre le cancer déclarée il y a 50 ans 8,9. L’un des plus grands obstacles a été de comprendre comment les cellules cancéreuses envahissent activement le tissu. Les principaux mécanismes d’invasion reposent sur les mêmes principes que ceux régissant la migration des cellules non tumorales10. Cependant, des spécificités de migration des cellules cancéreuses ontémergé11, déclenchant la nécessité d’une meilleure caractérisation de ce type de migration. Plus précisément, parce que le microenvironnement tumoral apparaît comme un acteur clé de la progression du cancer12, l’observation et l’analyse de l’invasion des cellules cancéreuses dans un contexte physiologique pertinent sont essentielles pour démêler les mécanismes de dissémination des cellules cancéreuses.
Les MT sont essentielles à la progression du cancer, pour soutenir à la fois la prolifération et l’invasion. Une analyse précise de la dynamique de la MT in situ peut aider à identifier les agents altérant la MT (MTA) dans les deux processus. La dynamique de la traduction automatique varie considérablement en fonction d’un changement d’environnement. In vitro, le traitement avec des agents déstabilisants MT tels que le nocodazole empêche la formation de saillies cellulaires lorsque les cellules sont intégrées dans des gels en 3D, alors qu’il a peu d’effet sur la migration cellulaire 2D13,14. Bien que techniquement difficiles, les progrès de l’imagerie intravitale permettent une analyse in vivo de la dynamique de la MT pendant l’invasion des cellules cancéreuses. Par exemple, l’observation des MT dans les cellules de fibrosarcome xénogreffées par voie sous-cutanée chez la souris a révélé que les macrophages associés aux tumeurs affectent la dynamique de la MT dans les cellules tumorales15. Cependant, ces modèles murins impliquent des procédures chirurgicales étendues et restent insatisfaisants pour les cancers moins accessibles, tels que la tumeur cérébrale hautement invasive, GBM.
Malgré un temps de survie moyen lamentable de 15 mois16, on sait peu de choses sur le mode de dissémination du GBM dans le parenchyme cérébral ou sur les éléments moléculaires clés soutenant l’invasion des cellules GBM dans le tissu cérébral. L’amélioration du modèle de xénogreffe orthotopique de souris (PDX) et l’établissement de fenêtres crâniennes ont offert de nouvelles perspectives pour les études d’invasion cellulaire GBM17,18. Cependant, en raison de la qualité d’imagerie sous-optimale, ce modèle a principalement permis l’imagerie longitudinale de xénogreffes superficielles et n’a pas été utilisé avec succès pour étudier l’imagerie subcellulaire des protéines du cytosquelette jusqu’à présent. De plus, à la suite de l’injonction des « 3R » visant à réduire l’utilisation des rongeurs et à les remplacer par des vertébrés inférieurs, des modèles alternatifs ont été établis.
Profitant de l’immunité primitive observée chez les larves de poisson zèbre (Danio rerio), l’injection orthotopique de cellules GBM dans le cerveau des poissons a été développée 19,20,21. L’injection au voisinage des ventricules dans le mésencéphale en développement récapitule la majeure partie de la physiopathologie du GBM humain21, et le même schéma préféré d’invasion du GBM que chez les humains – cooptation des vaisseaux – est observé22. Grâce à la transparence des larves de poissons, ce modèle permet de visualiser les cellules GBM envahissant le cerveau à partir des zones péri-ventriculaires où la plupart des GBM apparaîtraient23.
Étant donné que les MT sont essentielles pour l’invasion cellulaire du GBM in vitro24,25, une meilleure caractérisation de la dynamique de la magnétothérapie et l’identification des régulateurs clés pendant l’invasion cellulaire sont nécessaires. Cependant, à ce jour, les données générées avec le modèle orthotopique du poisson zèbre n’ont pas inclus l’analyse subcellulaire de la dynamique de la magnétoscopie pendant le processus d’invasion. Cet article fournit un protocole pour étudier la dynamique de la MT in vivo et déterminer son rôle lors de l’invasion du cancer du cerveau. Après un marquage stable des microtubules, les cellules GBM sont microinjectées à 3 dpf dans le cerveau des larves de poisson zèbre et imagées en temps réel à haute résolution spatio-temporelle au cours de leur progression dans le tissu cérébral. L’imagerie en direct des MT fluorescentes permet l’analyse qualitative et quantitative de la dynamique de la MT plus-end. De plus, ce modèle permet d’évaluer en temps réel l’effet des MTA sur la dynamique de la MT et sur les propriétés invasives des cellules GBM. Ce protocole relativement non invasif combiné à un grand nombre de larves manipulées à la fois et à la facilité d’application du médicament (dans l’eau des poissons) fait du modèle un atout pour les essais précliniques.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’imagerie des xénogreffes tumorales à une résolution unicellulaire est susceptible de devenir un outil indispensable pour améliorer notre compréhension de la biologie du GBM. L’imagerie en direct dans des modèles PDX murins a conduit à des découvertes précieuses sur la façon dont le GBM envahit collectivement le tissu cérébral18. Cependant, à ce jour, la résolution spatio-temporelle n’est pas assez élevée pour révéler la dynamique des protéines contrôlant l’invasion du…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes extrêmement reconnaissants au Dr P. Herbomel (Institut Pasteur, France) et à son laboratoire, en particulier Valérie Briolat et Emma Colucci-Guyon de nous avoir fourni les lignes de poisson zèbre et le moule en plastique pour les plaques de micro-injection, et pour leur précieuse expertise sur les procédures expérimentales du poisson zèbre. Nous remercions l’UtechS Photonic BioImaging (C2RT), Institut Pasteur, soutenu par l’Agence Nationale de la Recherche France BioImaging Français, et ANR-10-INBS-04 ; investissements pour l’avenir). Ce travail a été soutenu par la Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), le Centre National de la Recherche Scientifique, et l’Institut Pasteur et par les généreux dons de Mme Marguerite MICHEL et M. Porquet.
Materials
| Glioblastoma cell culture | |||
| Foetal calf serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | Reagent |
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | Reagent |
| Modified Eagle's medium | Eurobio | CM1MEM18-01 | Reagent |
| Penicillin–streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| U-87 MG | ECACC | 89081402-1VL | Cells |
| Lenitivirus production | |||
| BD FACSAria III | BD bioscience | Instrument | |
| BD FACSDiva software v8.0 | BD bioscience | Software | |
| HEK-293T | Merck | 12022001 | Cells |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | Reagent |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | Reagent |
| Ultracentrifuge Optima XPN-80 | Beckman Coulter | Instrument | |
| Cell passaging and staining | |||
| dPBS | Gibco | 14190-094 | Chemical |
| Hoechst 34580 | Sigma-Aldrich | 63493 | Chemical |
| Trypsin-EDTA (0,05%) | Gibco | 25300-054 | Reagent |
| Zebrafish husbandry | |||
| Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC | LEICA | https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ | Instrument |
| Methylene Blue hydrate | Sigma-Aldrich | M4159 | Chemical |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-25G | Chemical |
| Transfer Pipettes fine tips | Samco Scientific | 232 | Equipment |
| Transfer Pipettes Large Bulb3mL | Samco Scientific | 225 | Equipment |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | Cat#: A5040 | Chemical |
| Volvic Source Water | DUTSCHER DOMINIQUE SAS | 999556 | Reagent |
| Xenotransplantation | |||
| 24-well plate | TPP | 92024 | Equipment |
| Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) | Harvard Apparatus | (#30-0017 GC100-15 | Equipment |
| CellTram oil vario microinjector | Eppendorf | 5176000.025 | Instrument |
| Microloading pipet tips (Microloader) 20µL | Eppendorf | 5242956003 | Equipment |
| Micromanipulator | NARISHIGE | https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html | Equipment |
| Mineral Oil | Sigma | M8410-100ml | Equipment |
| Stereomicroscope | Olympus | KL 2500 LCD | Instrument |
| Universal capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | Equipment |
| Vertical Pipette puller | KOPF (Roucaire) | Model 720 | Instrument |
| Intravital Imaging | |||
| 3.5cm glass-bottom videoimaging dish | MatTek Life Sciences, MA, USA | P35G-1,5-14-C | Equipment |
| Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 | Nikon | Software | |
| Heat-Block | Techne | DRI-BLOCK DB-2D | Equipment |
| Microscope head Nikon Ti2E | Nikon | Instrument | |
| sCMOS camera Prime 95B | Photometrics | Instrument | |
| sCMOS camera Orca Flash 4 | Hammatsu | Instrument | |
| Ultrapure Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | Chemical |
| Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit | Hammatsu | Instrument | |
| Drug Treatment | |||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Chemical |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG | Chemical |
| Image Analysis | |||
| Imaris 9.5.1 software | Oxford Instruments | Software | |
| ImarisFileConverter 9.5.1 | Oxford Instruments | Software |
Riferimenti
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