Live-Bildgebung der Mikrotubulidynamik in Glioblastomzellen, die in das Zebrafischgehirn eindringen
Summary
Wir berichten über eine Technik, die eine Live-Bildgebung der Mikrotubulidynamik in Glioblastomzellen (GBM) ermöglicht, die in ein Hirngewebe von Wirbeltieren eindringen. Die Kopplung der orthotopischen Injektion von fluoreszenzmarkierten GBM-Zellen in ein transparentes Zebrafischgehirn mit hochauflösender intravitaler Bildgebung ermöglicht die Messung der Dynamik des Zytoskeletts während der in situ Krebsinvasion.
Abstract
Mit einer düsteren mittleren Überlebenszeit in realen Populationen – zwischen 6 und 15 Monaten – ist das Glioblastom (GBM) der verheerendste bösartige Hirntumor. Das Behandlungsversagen ist hauptsächlich auf die Invasivität der GBM-Zellen zurückzuführen, was für die Notwendigkeit eines besseren Verständnisses der beweglichen Eigenschaften von GBM spricht. Um den molekularen Mechanismus zu untersuchen, der die GBM-Invasion unterstützt, sind neue physiologische Modelle erforderlich, die eine eingehende Charakterisierung der Proteindynamik während der Invasion ermöglichen. Diese Beobachtungen würden den Weg zur Entdeckung neuer Ziele ebnen, um die Tumorinfiltration zu blockieren und die Patientenergebnisse zu verbessern. Dieser Artikel berichtet, wie ein orthotopes Xenotransplantat von GBM-Zellen im Zebrafischgehirn subzelluläre intravitale Live-Bildgebung ermöglicht. Wir konzentrieren uns auf Mikrotubuli (MTs) und beschreiben ein Verfahren zur MT-Markierung in GBM-Zellen, zur Mikroinjektion von GBM-Zellen in das transparente Gehirn von Zebrafischlarven 3 Tage nach der Befruchtung (dpf), zur intravitalen Bildgebung von MTs in den sich ausbreitenden Xenotransplantaten, zur Veränderung der MT-Dynamik, um ihre Rolle während der GBM-Invasion zu bewerten, und zur Analyse der erfassten Daten.
Introduction
Zellmotilität ist ein stereotyper Prozess, der die Etablierung der Polaritätsachse und krafterzeugende Umlagerungen des Zytoskeletts erfordert. Die Aktinpolymerisation und ihre Assoziation mit Myosin gelten als die Hauptursachen für protrusive und kontraktile Kräfte, die für die Zellbewegung erforderlich sind1. Mikrotubuli gelten als Hauptakteure der Zellpolarisation und der gerichteten Persistenz während der Migration2. In den letzten Jahren wurde auch gezeigt, dass MTs Vorsprünge erzeugen und stabilisieren, um mechanokompressive Kräfte während der Zellinvasion in 3D3 zu unterstützen. In jüngerer Zeit waren MTs direkt an der Mechanotransduktion an fokalen Adhäsionen und mechanosensitiver Migration beteiligt4. Die dynamische Instabilität, die die MT-plus-Enddynamik charakterisiert, besteht aus wiederholten Phasen der Polymerisation (Wachstum) und Depolymerisation (Schrumpfung), die durch eine Vielzahl von Mikrotubuli-bindenden Proteinen und intrazellulären Signalkaskaden gesteuert werden, wie sie von RHO-GTPasen 5,6,7 gesteuert werden. Die Rolle des MT-Netzwerks bei der Zellmigration und -invasion hat die Untersuchung der MT-Dynamik zu einem Schlüsselelement gemacht, um die Mechanismen des Immunzell-Homing, der Wundheilung und der Krebsinvasion besser zu verstehen.
Die Fähigkeit von Krebszellen, dem primären Tumorkern zu entkommen, sich im Gewebe auszubreiten und sekundäre Tumore zu erzeugen, ist ein entscheidender Schritt, um den globalen Erfolg im Krieg gegen den Krebs zu verhindern, der vor 50 Jahren erklärt wurde 8,9. Eine der größten Hürden war zu verstehen, wie Krebszellen aktiv in das Gewebe eindringen. Wichtige Invasionsmechanismen beruhen auf den gleichen Prinzipien wie diejenigen, die die Migration nicht-tumoröser Zellen steuern10. Es sind jedoch Besonderheiten der Krebszellmigration aufgetreten11, was die Notwendigkeit einer besseren Charakterisierung dieser Art der Migration auslöst. Insbesondere weil die Tumormikroumgebung als Schlüsselrolle bei der Krebsprogression12 erscheint, ist die Beobachtung und Analyse der Krebszellinvasion in einem relevanten physiologischen Kontext unerlässlich, um die Mechanismen der Krebszellverbreitung zu entschlüsseln.
MTs sind von zentraler Bedeutung für das Fortschreiten von Krebs, um sowohl die Proliferation als auch die Invasion aufrechtzuerhalten. Eine präzise Analyse der MT-Dynamik in situ kann helfen, MT-verändernde Substanzen (MTA) di beiden Prozessen zu identifizieren. Die MÜ-Dynamik variiert drastisch bei einer Änderung der Umgebung. In vitro verhindert die Behandlung mit MT-destabilisierenden Wirkstoffen wie Nocodazol die Bildung von Zellprotrusionen, wenn Zellen in Gele in 3D eingebettet sind, während sie wenig Einfluss auf die 2D-Zellmigration hat13,14. Obwohl technisch anspruchsvoll, ermöglichen Fortschritte in der intravitalen Bildgebung eine In-vivo-Analyse der MT-Dynamik während der Invasion von Krebszellen. Zum Beispiel zeigte die Beobachtung von MTs in subkutan xenotransplantierten Fibrosarkomzellen in Mäusen, dass tumorassoziierte Makrophagen die MT-Dynamik in Tumorzellen beeinflussen15. Diese Mausmodelle beinhalten jedoch umfangreiche chirurgische Eingriffe und bleiben für weniger zugängliche Krebsarten wie den hochinvasiven Hirntumor GBM unbefriedigend.
Trotz einer düsteren durchschnittlichen Überlebenszeit von 15 Monaten16 ist wenig über die Art der Verbreitung von GBM innerhalb des Hirnparenchyms oder die wichtigsten molekularen Elemente, die die GBM-Zellinvasion im Hirngewebe unterstützen, bekannt. Die Verbesserung des orthotopen Xenograft-Modells (PDX) der Maus und die Etablierung von Schädelfenstern boten neue Perspektiven für GBM-Zellinvasionsstudien17,18. Aufgrund der suboptimalen Bildgebungsqualität hat dieses Modell jedoch weitgehend longitudinale Bildgebung von oberflächlichen Xenotransplantaten erlaubt und wurde bisher nicht erfolgreich zur Untersuchung subzellulärer Bildgebung von Zytoskelettproteinen eingesetzt. Darüber hinaus wurden im Zuge der “3R”-Anordnung, den Einsatz von Nagetieren zu reduzieren und sie durch niedere Wirbeltiere zu ersetzen, alternative Modelle etabliert.
Unter Ausnutzung der primitiven Immunität, die bei Zebrafischlarven (Danio rerio) beobachtet wurde, wurde eine orthotope Injektion von GBM-Zellen in das Fischgehirn entwickelt 19,20,21. Die Injektion in die Nähe der Ventrikel im sich entwickelnden Mittelhirn rekapituliert den größten Teil der menschlichen GBM-Pathophysiologie21, und das gleiche bevorzugte Muster der GBM-Invasion wie bei der Kooption der menschlichen Gefäße wird beobachtet22. Dank der Transparenz der Fischlarven ermöglicht dieses Modell die Visualisierung von GBM-Zellen, die aus den periventrikulären Bereichen, in denen die meisten GBMs entstehen sollen, in das Gehirn eindringen23.
Da MTs für die GBM-Zellinvasion in vitro24,25 unerlässlich sind, ist eine bessere Charakterisierung der MT-Dynamik und die Identifizierung von Schlüsselregulatoren während der Zellinvasion erforderlich. Bisher haben die mit dem Zebrafisch-Orthotopenmodell generierten Daten jedoch keine subzelluläre Analyse der MT-Dynamik während des Invasionsprozesses berücksichtigt. Dieses Papier bietet ein Protokoll, um die MT-Dynamik in vivo zu untersuchen und ihre Rolle während der Invasion von Hirntumoren zu bestimmen. Nach stabiler Mikrotubuli-Markierung werden GBM-Zellen mit 3 dpf in die Gehirne von Zebrafischlarven mikroinjiziert und in Echtzeit mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung während ihrer Progression im Hirngewebe abgebildet. Die Live-Bildgebung von fluoreszierenden MTs ermöglicht die qualitative und quantitative Analyse der MT-Plus-End-Dynamik. Darüber hinaus ermöglicht dieses Modell, den Einfluss von MTAs auf die MT-Dynamik und die invasiven Eigenschaften von GBM-Zellen in Echtzeit zu bewerten. Dieses relativ nicht-invasive Protokoll in Kombination mit einer großen Anzahl von Larven, die gleichzeitig gehandhabt werden, und der einfachen Anwendung von Medikamenten (im Fischwasser) macht das Modell zu einem Vorteil für präklinische Tests.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Bildgebung von Tumor-Xenotransplantaten mit Einzelzellauflösung wird wahrscheinlich zu einem unverzichtbaren Werkzeug, um unser Verständnis der GBM-Biologie zu verbessern. Live-Bildgebung in Maus-PDX-Modellen hat zu wertvollen Entdeckungen darüber geführt, wie GBM kollektiv in das Hirngewebe eindringt18. Bisher ist die raumzeitliche Auflösung jedoch nicht hoch genug, um die Dynamik von Proteinen aufzudecken, die die GBM-Invasion steuern. Wir argumentierten, dass durch die Kopplung der ort…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, Frankreich) und seinem Labor, insbesondere Valérie Briolat, und Emma Colucci-Guyon für die Bereitstellung der Zebrafischlinien und der Kunststoffform für Mikroinjektionsplatten sowie für ihr wertvolles Know-how über experimentelle Verfahren von Zebrafischen. Wir danken dem UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, unterstützt von der französischen National Research Agency France BioImaging, und ANR-10-INBS-04; Investitionen in die Zukunft). Diese Arbeit wurde von der Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), dem Centre National de la Recherche Scientific und dem Institut Pasteur sowie durch die großzügigen Spenden von Frau Marguerite MICHEL und Herrn Porquet.
Materials
| Glioblastoma cell culture | |||
| Foetal calf serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | Reagent |
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | Reagent |
| Modified Eagle's medium | Eurobio | CM1MEM18-01 | Reagent |
| Penicillin–streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| U-87 MG | ECACC | 89081402-1VL | Cells |
| Lenitivirus production | |||
| BD FACSAria III | BD bioscience | Instrument | |
| BD FACSDiva software v8.0 | BD bioscience | Software | |
| HEK-293T | Merck | 12022001 | Cells |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | Reagent |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | Reagent |
| Ultracentrifuge Optima XPN-80 | Beckman Coulter | Instrument | |
| Cell passaging and staining | |||
| dPBS | Gibco | 14190-094 | Chemical |
| Hoechst 34580 | Sigma-Aldrich | 63493 | Chemical |
| Trypsin-EDTA (0,05%) | Gibco | 25300-054 | Reagent |
| Zebrafish husbandry | |||
| Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC | LEICA | https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ | Instrument |
| Methylene Blue hydrate | Sigma-Aldrich | M4159 | Chemical |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-25G | Chemical |
| Transfer Pipettes fine tips | Samco Scientific | 232 | Equipment |
| Transfer Pipettes Large Bulb3mL | Samco Scientific | 225 | Equipment |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | Cat#: A5040 | Chemical |
| Volvic Source Water | DUTSCHER DOMINIQUE SAS | 999556 | Reagent |
| Xenotransplantation | |||
| 24-well plate | TPP | 92024 | Equipment |
| Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) | Harvard Apparatus | (#30-0017 GC100-15 | Equipment |
| CellTram oil vario microinjector | Eppendorf | 5176000.025 | Instrument |
| Microloading pipet tips (Microloader) 20µL | Eppendorf | 5242956003 | Equipment |
| Micromanipulator | NARISHIGE | https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html | Equipment |
| Mineral Oil | Sigma | M8410-100ml | Equipment |
| Stereomicroscope | Olympus | KL 2500 LCD | Instrument |
| Universal capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | Equipment |
| Vertical Pipette puller | KOPF (Roucaire) | Model 720 | Instrument |
| Intravital Imaging | |||
| 3.5cm glass-bottom videoimaging dish | MatTek Life Sciences, MA, USA | P35G-1,5-14-C | Equipment |
| Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 | Nikon | Software | |
| Heat-Block | Techne | DRI-BLOCK DB-2D | Equipment |
| Microscope head Nikon Ti2E | Nikon | Instrument | |
| sCMOS camera Prime 95B | Photometrics | Instrument | |
| sCMOS camera Orca Flash 4 | Hammatsu | Instrument | |
| Ultrapure Low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | Chemical |
| Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit | Hammatsu | Instrument | |
| Drug Treatment | |||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Chemical |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404-2MG | Chemical |
| Image Analysis | |||
| Imaris 9.5.1 software | Oxford Instruments | Software | |
| ImarisFileConverter 9.5.1 | Oxford Instruments | Software |
Riferimenti
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