Mikrotensiometer zur konfokalen Mikroskopie Visualisierung dynamischer Grenzflächen

Summary

Dieses Manuskript beschreibt das Design und den Betrieb eines Mikrotensiometers / Konfokalmikroskops zur gleichzeitigen Messung der Grenzflächenspannung und der Oberflächendilatationsrheologie bei gleichzeitiger Visualisierung der Grenzflächenmorphologie. Dies ermöglicht die Echtzeitkonstruktion von Struktur-Eigenschafts-Beziehungen von Schnittstellen, die für Technologie und Physiologie wichtig sind.

Abstract

Die Adsorption von oberflächenaktiven Molekülen an Fluid-Fluid-Grenzflächen ist in der Natur allgegenwärtig. Die Charakterisierung dieser Grenzflächen erfordert die Messung der Adsorptionsraten von Tensiden, die Bewertung der Gleichgewichtsoberflächenspannungen als Funktion der Massentensidkonzentration und die Beziehung, wie sich die Oberflächenspannung mit Änderungen im Grenzflächenbereich nach dem Gleichgewicht ändert. Die gleichzeitige Visualisierung der Grenzfläche mittels Fluoreszenzbildgebung mit einem Hochgeschwindigkeits-Konfokalmikroskop ermöglicht die direkte Auswertung von Struktur-Funktions-Beziehungen. Im Kapillardruck-Mikrotensiometer (CPM) wird eine halbkugelförmige Luftblase am Ende der Kapillare in einem 1 ml Volumenflüssigkeitsreservoir eingeklemmt. Der Kapillardruck über die Blasengrenzfläche wird über einen kommerziellen mikrofluidischen Durchflussregler gesteuert, der eine modellbasierte Druck-, Blasenkrümmungs- oder Blasenflächensteuerung auf der Grundlage der Laplace-Gleichung ermöglicht. Im Vergleich zu früheren Techniken wie dem Langmuir-Trog und dem Pendelfall werden die Mess- und Regelpräzision und die Reaktionszeit erheblich verbessert. Kapillardruckschwankungen können in Millisekunden angelegt und gesteuert werden. Die dynamische Reaktion der Blasenschnittstelle wird über eine zweite optische Linse visualisiert, wenn sich die Blase ausdehnt und zusammenzieht. Die Blasenkontur ist an ein kreisförmiges Profil angepasst, um den Blasenkrümmungsradius R sowie Abweichungen von der Zirkularität zu bestimmen, die die Ergebnisse ungültig machen würden. Die Laplace-Gleichung wird verwendet, um die dynamische Oberflächenspannung der Grenzfläche zu bestimmen. Nach dem Ausgleich können kleine Druckschwingungen von der computergesteuerten mikrofluidischen Pumpe auferlegt werden, um den Blasenradius (Frequenzen von 0,001-100 Zyklen/min) zu schwingen, um den Dilatationsmodul zu bestimmen Die Gesamtabmessungen des Systems sind so klein, dass das Mikrotensiometer unter die Linse eines konfokalen Hochgeschwindigkeitsmikroskops passt, so dass fluoreszierend markierte chemische Spezies quantitativ mit einer lateralen Auflösung von Submikrometern verfolgt werden können.

Introduction

Luft-Wasser-Grenzflächen, die von Tensidfilmen bedeckt werden, sind im täglichen Leben allgegenwärtig. Tensid-Wasser-Injektionen werden verwendet, um die Ölgewinnung aus erschöpften Feldern zu verbessern und werden als hydraulische Fracturing-Lösungen für Schiefergas und -öl verwendet. Gas-Flüssig-Schäume und Flüssig-Flüssig-Emulsionen sind in vielen industriellen und wissenschaftlichen Prozessen als Schmier- und Reinigungsmittel üblich und in Lebensmitteln üblich. Tenside und Proteine an Grenzflächen stabilisieren Antikörperkonformationen während der Verpackung, Lagerung und Verabreichung 1,2,3,4,5, Tränenfilmstabilität im Auge ^6,7,8 und Lungenmechanik 9,10,11,12,13,14^{, 15}.

Die Untersuchung von grenzflächenaktiven Wirkstoffen oder grenzflächenadsorbierenden Tensiden und deren Eigenschaften hat eine lange Geschichte mit vielen verschiedenen experimentellen Techniken 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Eine neuere Entwicklung ist das Kapillardruck-Mikrotensiometer (CPM), das die Untersuchung von Grenzflächeneigenschaften an stark gekrümmten Grenzflächen auf viel kleineren Längenskalen ermöglicht, während deutlich weniger Materialien verwendet werden als andere gängige Methoden 9,23,24,25. Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie (CFM) kann verwendet werden, um die Morphologie von Lipiden und Proteinen an den Luft-Wasser-Grenzflächen im CPM²² oder an Langmuir-Trögen^{20,26,27,28,29} zu untersuchen. Hier wurden CPM und CFM kombiniert, um morphologische Phänomene mit dynamischen und Gleichgewichtsgrenzflächeneigenschaften zu verbinden, um Struktur-Funktions-Beziehungen für biologische und technologische Grenzflächen zu entwickeln.

Es gibt zahlreiche wichtige Parameter in Grenzflächen-Tensidsystemen, die dem CPM-CFM zugänglich sind. Im CPM wird eine Luftblase mit einem Durchmesser von 30-200 μm an die Spitze eines Glaskapillarrohrs geheftet. In früheren Versionen des CPM wurde die Kapillardruckdifferenz zwischen der Innen- und Außenseite der Blase über eine Wassersäule und eine oszillierende Spritzenpumpe^{gesteuert 9,30} ; Die hier beschriebene neue Version ersetzt diese durch eine präzisere, computergesteuerte Mikrofluidikpumpe. Die Oberflächenspannung (γ) wird über die Laplace-Gleichung, ΔP = 2γ/R, aus dem Druckabfall über die von der Pumpe, ΔP, eingestellte Grenzfläche und der optischen Analyse des Krümmungsradius der Blase, R, bestimmt. Die dynamische Oberflächenspannung der Grenzfläche kann mit einer Zeitauflösung von 10 ms nach der Erzeugung einer neuen Blase in Kontakt mit einer Schüttflüssigkeit, die ein lösliches Tensid enthält, bestimmt werden. Die Adsorptionsdynamik des Tensids kann durch die klassische Ward-Tordai-Gleichung^10,31 beschrieben werden, um wesentliche Eigenschaften des Tensids zu bestimmen, einschließlich der Diffusivität^, der Oberflächenbedeckung und der Beziehung zwischen Massenkonzentration und Gleichgewichtsoberflächenspannung^. Sobald eine Gleichgewichtsoberflächenspannung erreicht ist, kann der Grenzflächenbereich oszilliert werden, um den Dilatationsmodul zu messen, indem die Änderungen der Oberflächenspannung aufgezeichnet werden, die durch kleine Änderungen der Blasenoberfläche induziert werden, A³². Für komplexere Grenzflächen, die eigene innere Strukturen wie verschränkte Polymere oder Proteine entwickeln, wird die Oberflächenspannung, , durch eine allgemeinere Oberflächenspannung^{ersetzt 4,33,} .

Die Lungenstabilität während der Atmung kann direkt an die Aufrechterhaltung einer niedrigen Oberflächenspannung und eines hohen Dilatationsmoduls an der alveolären Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche ^9,10 gebunden sein. Alle inneren Lungenoberflächen sind mit einem kontinuierlichen, mikrometerdicken Film aus Epithelauskleidungsflüssigkeit ausgekleidet, um die Hydratation des Gewebes^{aufrechtzuerhalten 34}. Diese Epithelauskleidungsflüssigkeit besteht hauptsächlich aus Wasser, mit Salzen und verschiedenen anderen Proteinen, Enzymen, Zuckern und Lungentensid. Wie bei jeder gekrümmten Flüssigkeits-Dampf-Grenzfläche wird ein Kapillardruck induziert, wobei der Druck auf der Innenseite der Alveole (oder Blase) höher ist. Wenn die Oberflächenspannung jedoch überall in der Lunge konstant war, zeigt die Laplace-Gleichung, ΔP = 2γ / R, dass kleinere Alveolen einen höheren Innendruck im Vergleich zu größeren Alveolen haben würden, wodurch der Gasgehalt der kleineren Alveolen gezwungen würde, zu größeren, niedrigeren Druckalveolen zu fließen. Dies wird als “Laplace-Instabilität” ^{bezeichnet9,35}. Das Endergebnis ist, dass die kleinsten Alveolen kollabieren und mit Flüssigkeit gefüllt werden und schwer wieder aufzublasen sind, was dazu führt, dass ein Teil der Lunge kollabiert, und andere Teile würden sich überblähen, was beides typische Symptome des akuten Atemnotsyndroms (ARDS) sind. In einer gut funktionierenden Lunge ändert sich die Oberflächenspannung jedoch dynamisch, da sich die Luft-Epithel-Flüssigkeitsgrenzfläche im Grenzflächenbereich der Alveolus während der Atmung ausdehnt und zusammenzieht. Wenn , oder , nimmt der Laplace-Druck mit abnehmendem Radius ab und nimmt mit zunehmendem Radius zu, um die Laplace-Instabilität zu beseitigen und dadurch die Lunge zu stabilisieren⁹. Daher und wie es von der Frequenz, der Monolayer-Morphologie und -Zusammensetzung und der Zusammensetzung der Alveolarflüssigkeit abhängt, kann für die Lungenstabilität unerlässlich sein. Das CPM-CFM hat auch die ersten Demonstrationen der Auswirkungen der Grenzflächenkrümmung auf die Tensidadsorption²⁵, die Monolayer-Morphologie²² und den Dilatationsmodul⁹ geliefert. Das geringe Volumen (~1 ml) des Reservoirs im CPM ermöglicht die schnelle Einführung, Entfernung oder den Austausch der flüssigen Phase und minimiert die erforderliche Menge an teuren Proteinen oder Tensiden¹⁰.

Der Kontrast in einem CPM-CFM-Bild ist auf die Verteilung kleiner Fraktionen fluoreszierend markierter Lipide oder Proteine an der Grenzfläche ^16,27 zurückzuführen. Zweidimensionale Tensid-Monoschichten weisen häufig eine laterale Phasentrennung als Funktion der Oberflächenspannung oder des Oberflächendrucks auf, π die Differenz zwischen der Oberflächenspannung einer sauberen Fluid-Fluid-Grenzfläche, _{γ 0}, und einer mit Tensiden bedeckten Grenzfläche, γ. π kann als der 2D-“Druck” angesehen werden, der durch die Wechselwirkungen von Tensidmolekülen an der Grenzfläche verursacht wird, die die Oberflächenspannung der reinen Flüssigkeit senken. Bei niedrigen Oberflächendrücken befinden sich Lipidmonoschichten in einem flüssigkeitsähnlichen, unorganisierten Zustand; Dies wird als flüssig expandierte (LE) Phase bezeichnet. Wenn der Oberflächendruck zunimmt und die Fläche pro Lipidmolekül abnimmt, orientieren sich die Lipide aneinander und können einen Phasenübergang erster Ordnung in die langreichweitig geordnete flüssig kondensierte (LC) Phase 16,20,27 durchlaufen. Die LE- und LC-Phasen können bei verschiedenen Oberflächendrücken koexistieren und können visualisiert werden, da fluoreszierend markierte Lipide aus der LC-Phase ausgeschlossen sind und sich in die LE-Phase trennen. Somit ist die LE-Phase hell und die LC-Phase ist dunkel, wenn sie mit CFM¹⁶ abgebildet wird.

Das Ziel dieses Manuskripts ist es, die Schritte zu beschreiben, die notwendig sind, um das kombinierte konfokale Mikroskop-Mikrotensiometer zu bauen und zu betreiben. Dies ermöglicht es dem Leser, Adsorptionsstudien durchzuführen, die Oberflächenspannung und das rheologische Verhalten zu messen und gleichzeitig die Grenzflächenmorphologie an einer Luft-Wasser- oder Öl-Wasser-Grenzfläche im Mikrometerbereich zu untersuchen. Dazu gehört eine Diskussion darüber, wie die erforderlichen Kapillaren gezogen, geschnitten und hydrophobiziert werden können, Anweisungen für die Verwendung von Druck-, Krümmungs- und Oberflächensteuerungsmodi sowie die Grenzflächenübertragung von unlöslichem Tensid auf die gekrümmte Mikrotensiometergrenzfläche.

Protocol

1. Vorbereitung der Kapillarröhrchen Legen Sie die Kapillare in einen Kapillarzieher und führen Sie das gewünschte Zugprogramm aus, um zwei sich verjüngende Kapillaren mit einem Außendurchmesser (OD) von ~ 1 μm an der Spitze herzustellen.HINWEIS: Das OD der Kapillare vor dem Ziehen muss das OD sein, das angegeben wurde, um in den Kapillarhalter in der Mikrotensiometerzelle zu passen. Der Innendurchmesser (ID) der Kapillare kann variieren, beeinflusst aber den kritischen Radius der Kap…

Representative Results

Eine Hauptquelle für Messfehler ergibt sich aus den Kapillaren, die entweder Defekte aus dem Schneidprozess (Abbildung 5A, B) oder dem Beschichtungsprozess (Abbildung 5D) aufweisen. Beide Arten von Defekten führen zu Fehlern bei der Bestimmung der Blasenform und -größe durch das optische Bildanalysesystem, was zu ungenauen Oberflächenspannungswerten führt. Es ist wichtig, jede neue Kapillare sorgfältig zu untersuchen, nachdem sie gezogen …

Discussion

Das kombinierte CPM/CFM ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Grenzflächendynamik, Gleichgewichten und Morphologie. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die zum Abrufen von Daten mit CPM/CFM erforderlich sind.

Abbildung 2 zeigt das Zelldesign mit Kanälen für den angegebenen Kapillar-, Lösungsmittel- und Wärmeaustausch. Der Einlass für den Lösungsmittelaustausch sollte sich an der Unterseite der Zelle befinden, während sich der Auslas…

Materials

1.5 O.D. Tygon tubing	Fischer Scientific		Tubing
A1RHD Multiphoton upright confocal microscope	Nikon		Confocal Microscope
Acid Cleaning Solution			Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting
Alnochromix	Alconox	2510	Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution
Ceramic glass cutter	Sutter Instruments
Chloroform	Sigma-Aldrich	650471	HPLC Plus
Curosurf	Chiesi		Lung Surfactant
Di Water			18.5 MΩ – cm
Ethanol	any		200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator	Dolan-Jenner Industries Inc.	281900100	Light source; other light sources should work as well
Flow EZ F69 mbar w/Link Module	Fluigent	LU-FEZ-0069	Microfluidic Pump
Fluigent SDK VIs	Fluigent		Required for CPM virtual Interface
Fluoroelastomer gaskets			Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3
Gas filter	Norgren	F07-100-A3TG	Put between microfluidic pump and pressure regulator
Gas regulator	Norgren	10R0400R	Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi
Glass Capilary	Sutter Instruments	B150-86-10	Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm
Glass Slide	any		75 mm x 25 mm
Glass Syringe	Hamilton	84878	25 μL glass syringe
Hydrophobizing Agent	Sigma-Aldrich	667420	1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted
Insoluble surfactant	Avanti	850355C-200mg	16:0 DPPC in chloroform
LabVIEW Software	National Instruments		2017
Longpass Filter	ThorLabs	FEL0650	650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence
Lyso-PC	Avanti	855675P	16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/  Easy-Load II pump head	Masterflex	HV-77916-20	Peristaltic Pump
MATLAB	Mathworks		R2019
Micropipette Puller P-1000	Sutter Instruments		Capillary Puller
Microtensiometer Cell and Holder			Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4
Microtensiometer Objective	Nikon		Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm
NI Vision Development Module	National Instruments		Required for CPM virtual Interface
PEEK finger tight fittings	IDEX	F-120x	10-32 Coned Ports
PEEK plug	IDEX	P-551	10-31 Coned Ports
pippette tips	Eppendorf	22492225	100 μL – 1000 μL, Autoclaved
Plastic Forceps	Thermo Scientific	6320-0010
Plastic Syringe	Fischer Scientific	14-955-459	10 mL
Plumbing parts	Fischer Scientific		3-way valves and other plumbing parts to connect tubing.
Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL	Eppendorf	3123000063	Micro pipetter
Sulfuric Acid	any		Used for acid cleaning solution
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm	Nikon		Confocal Microscope Objective
Texas Red DHPE triethylammonim salt	Thermo Fischer Scientific	1395MP	Fluorophore
Vaccum Pump	Gast	DOA-P704-AA