Mikrotensiometer til konfokal mikroskopi Visualisering af dynamiske grænseflader

Summary

Dette manuskript beskriver design og drift af et mikrotensiometer / konfokalt mikroskop til at foretage samtidige målinger af grænsefladespænding og overfladedilatationel reologi, mens man visualiserer grænseflademorfologien. Dette giver realtidskonstruktion af struktur-ejendomsforhold af grænseflader, der er vigtige inden for teknologi og fysiologi.

Abstract

Adsorption af overfladeaktive molekyler til væske-væske-grænseflader er allestedsnærværende. Karakterisering af disse grænseflader kræver måling af overfladeaktive stoffers adsorptionshastigheder, evaluering af ligevægtsoverfladespændinger som funktion af koncentrationen af overfladeaktive stoffer i bulk og relaterer, hvordan overfladespændingen ændres med ændringer i grænsefladeområdet efter ligevægt. Samtidig visualisering af grænsefladen ved hjælp af fluorescensbilleddannelse med et højhastighedskonfokalmikroskop muliggør direkte evaluering af struktur-funktionsforhold. I kapillærtrykmikrotensiometeret (CPM) fastgøres en halvkugleformet luftboble i slutningen af kapillæren i et 1 ml volumen væskereservoir. Kapillærtrykket over boblegrænsefladen styres via en kommerciel mikrofluidisk flowregulator, der giver mulighed for modelbaseret tryk- eller boblekrumningskontrol eller bobleområdekontrol baseret på Laplace-ligningen. Sammenlignet med tidligere teknikker som Langmuir-trug og vedhængsdråbe forbedres måle- og kontrolpræcisionen og responstiden kraftigt; kapillærtrykvariationer kan påføres og kontrolleres i millisekunder. Boblegrænsefladens dynamiske respons visualiseres via en anden optisk linse, når boblen udvider sig og trækker sig sammen. Boblekonturen passer til en cirkulær profil for at bestemme boblekrumningsradius, R, samt eventuelle afvigelser fra cirkularitet, der ville ugyldiggøre resultaterne. Laplace-ligningen bruges til at bestemme grænsefladens dynamiske overfladespænding. Efter ækvilibrering kan små trykoscillationer pålægges af den computerstyrede mikrofluidpumpe for at svinge bobleradiusen (frekvenser på 0,001-100 cyklusser / min) for at bestemme dilatationsmodulet Systemets overordnede dimensioner er tilstrækkeligt små til, at mikrotensiometeret passer under linsen i et højhastighedskonfokalmikroskop, der gør det muligt at spore fluorescerende mærkede kemiske arter kvantitativt med submikron lateral opløsning.

Introduction

Luft-vand-grænseflader, der er dækket af overfladeaktive film, er allestedsnærværende i det daglige liv. Injektioner med overfladeaktivt vand bruges til at forbedre olieindvindingen fra udtømte felter og bruges som hydrauliske fraktureringsløsninger til skifergas og olie. Gas-flydende skum og flydende-flydende emulsioner er fælles for mange industrielle og videnskabelige processer som smøremidler og rengøringsmidler og er almindelige i fødevarer. Overfladeaktive stoffer og proteiner ved grænseflader stabiliserer antistofkonformationer under emballering, opbevaring og administration ^1,2,3,4,5, tårefilmstabilitet i øjet ^6,7,8 og lungemekanik 9,10,11,12,13,14 ¹⁵.

Undersøgelsen af overfladeaktive stoffer eller overfladeaktive stoffer, der adsorberer til grænseflader og deres egenskaber, har en lang historie med mange forskellige eksperimentelle teknikker 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . En nylig udvikling er kapillærtrykmikrotensiometeret (CPM), som gør det muligt at undersøge grænsefladeegenskaber på stærkt buede grænseflader i meget mindre længdeskalaer, mens der anvendes betydeligt færre materialer end andre almindelige metoder 9,23,24,25. Konfokal fluorescensmikroskopi (CFM) kan bruges til at studere morfologien af lipider og proteiner ved luft-vand-grænsefladerne i CPM²² eller på Langmuir-trugene 20,26,27,28,29. Her er en CPM og CFM blevet kombineret for at forbinde morfologiske fænomener med dynamiske og ligevægts-grænsefladeegenskaber for at udvikle struktur-funktionsforhold for biologiske og teknologiske grænseflader.

Der er adskillige parametre af betydning i grænsefladeoverfladeaktive stoffer, der er tilgængelige for CPM-CFM. I CPM er en luftboble på 30-200 μm diameter fastgjort til spidsen af et glaskapillærrør. I tidligere versioner af CPM blev kapillærtrykforskellen mellem indersiden og ydersiden af boblen styret via en vandsøjle og oscillerende sprøjtepumpe ^9,30 ; den nye version, der er beskrevet her, erstatter disse med en computerstyret mikrofluidisk pumpe med højere præcision. Overfladespændingen (γ) bestemmes via Laplace-ligningen, ΔP = 2γ / R, fra trykfaldet over grænsefladen indstillet af pumpen, ΔP, og optisk analyse af boblens krumningsradius, R. Grænsefladens dynamiske overfladespænding kan bestemmes med en tidsopløsning på 10 ms efter dannelsen af en ny boble i kontakt med en bulkvæske indeholdende et opløseligt overfladeaktivt stof. Det overfladeaktive stofs adsorptionsdynamik kan beskrives ved den klassiske Ward-Tordai-ligning^10,31 for at bestemme det overfladeaktive stofs væsentlige egenskaber, herunder diffusivitet, overfladedækning og forholdet mellem bulkkoncentration og ligevægtsoverfladespænding. Når en ligevægtsoverfladespænding er opnået, kan grænsefladeområdet oscilleres for at måle dilatationsmodulet, ved at registrere ændringerne i overfladespændingen, induceret af små ændringer i boblens overfladeareal, A³². For mere komplekse grænseflader, der udvikler deres egne indre strukturer såsom sammenfiltrede polymerer eller proteiner, erstattes overfladespændingen, , af en mere generel overfladespænding ^4,33, .

Lungestabilitet under vejrtrækning kan være direkte bundet til at opretholde både en lav overfladespænding og et højt dilatationsmodul ved den alveolære luft-væske-grænseflade ^9,10. Alle indre lungeoverflader er foret med en kontinuerlig, mikrontyk film af epitelforingsvæske for at opretholde vævshydrering³⁴. Denne epitelforingsvæske er primært vand med salte og forskellige andre proteiner, enzymer, sukkerarter og lungeoverfladeaktive stoffer. Som det er tilfældet for enhver buet væske-damp-grænseflade, induceres et kapillærtryk med trykket højere på indersiden af alveolus (eller boblen). Men hvis overfladespændingen var konstant overalt i lungerne, viser Laplace-ligningen, ΔP = 2γ / R, at mindre alveoler ville have et højere indre tryk i forhold til større alveoler, hvilket tvinger gasindholdet i de mindre alveoler til at strømme til større alveoler med lavere tryk. Dette er kendt som “Laplace Instability”^9,35. Nettoresultatet er, at de mindste alveoler ville kollapse og blive fyldt med væske og blive vanskelige at puste op igen, hvilket fik en del af lungen til at kollapse, og andre dele ville overoppustes, som begge er typiske symptomer på akut respiratorisk nødsyndrom (ARDS). I en korrekt fungerende lunge ændres overfladespændingen imidlertid dynamisk, da luft-epitelvæskegrænsefladen i alveolus-grænsefladeområdet udvides og trækker sig sammen under vejrtrækning. Hvis , eller , falder Laplace-trykket med faldende radius og stiger med stigende radius for at eliminere Laplace-ustabiliteten og derved stabilisere lungen⁹. Derfor, , og hvordan det afhænger af frekvens, monolagsmorfologi og sammensætning, og alveolær væskesammensætning kan være afgørende for lungestabilitet. CPM-CFM har også givet de første demonstrationer af virkningerne af grænsefladekrumning på overfladeaktiv adsorption²⁵, monolagsmorfologi²² og dilatationsmodul⁹. Det lille volumen (~ 1 ml) af reservoiret i CPM muliggør hurtig introduktion, fjernelse eller udveksling af væskefasen og minimerer den krævede mængde dyre proteiner eller overfladeaktive stoffer¹⁰.

Kontrast i et CPM-CFM-billede skyldes fordelingen af små fraktioner af fluorescerende mærkede lipider eller proteiner ved grænsefladen^16,27. Todimensionale overfladeaktive monolag udviser ofte lateral faseadskillelse som en funktion af overfladespænding eller overfladetryk, π er forskellen mellem overfladespændingen af en ren væske-væske-grænseflade, γ₀, og en overfladeaktivt stofdækket grænseflade, γ. π kan betragtes som 2-D “trykket” forårsaget af interaktionerne mellem overfladeaktive molekyler ved grænsefladen, der virker til at sænke den rene væskeoverfladespænding. Ved lavt overfladetryk er lipidmonolag i en væskelignende uorganiseret tilstand; dette er kendt som den væskeudvidede (LE) fase. Når overfladetrykket stiger, og arealet pr. lipidmolekyle falder, orienterer lipiderne sig med hinanden og kan gennemgå en første ordensfaseovergang til den langtrækkende bestilte væske kondenserede (LC) fase 16,20,27. LE- og LC-faserne kan eksistere sammen ved forskellige overfladetryk og kan visualiseres, da fluorescerende mærkede lipider udelukkes fra LC-fasen og adskilles til LE-fasen. LE-fasen er således lys, og LC-fasen er mørk, når den er afbildet med CFM¹⁶.

Målet med dette manuskript er at beskrive de trin, der er nødvendige for at opbygge og betjene det kombinerede konfokale mikroskop mikrotensiometer. Dette vil gøre det muligt for læseren at udføre adsorptionsundersøgelser, måle overfladespænding, reologisk adfærd og undersøge grænseflademorfologi samtidigt på en mikronskala luft / vand eller olie / vand-grænseflade. Dette inkluderer en diskussion af, hvordan man trækker, skærer og hydrofoberer de krævede kapillærer, instruktioner til brug af tryk-, krumnings- og overfladearealkontroltilstande og grænsefladeoverførsel af uopløseligt overfladeaktivt middel til mikrotensiometerets buede grænseflade.

Protocol

1. Fremstilling af kapillærrør Placer kapillæren i en kapillærudtrækker, og kør det ønskede trækprogram for at fremstille to koniske kapillærer med en udvendig diameter (OD) på ~ 1 μm ved spidsen.BEMÆRK: KAPILLÆRENS OD før træk skal være OD specificeret til at passe i kapillærholderen i mikrotensiometercellen. Kapillærens indre diameter (ID) kan variere, men vil påvirke kapillærens kritiske radius efter træk. Et trækprogram vælges således, at den resulterende konus o…

Representative Results

En væsentlig kilde til målefejl stammer fra kapillærerne, der har defekter enten fra skæreprocessen (figur 5A, B) eller belægningsprocessen (figur 5D). Begge typer defekter fører til fejl ved bestemmelse af bobleformen og størrelsen af det optiske billedanalysesystem, hvilket fører til unøjagtige overfladespændingsværdier. Det er vigtigt at undersøge hver ny kapillær omhyggeligt, efter at den er trukket og belagt under det optiske m…

Discussion

Den kombinerede CPM /CFM er et kraftfuldt værktøj til undersøgelse af grænsefladedynamik, ligevægte og morfologi. Denne protokol beskriver de trin, der er nødvendige for at indhente data med CPM/CFM.

Figur 2 viser celledesignet med kanaler til kapillær, opløsningsmiddel og varmeveksling angivet. Indløbet til opløsningsmiddeludveksling skal være i bunden af cellen, mens udløbet skal være øverst, så cellen ikke løber over under udvekslingen. I praksi…

Materials

1.5 O.D. Tygon tubing	Fischer Scientific		Tubing
A1RHD Multiphoton upright confocal microscope	Nikon		Confocal Microscope
Acid Cleaning Solution			Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting
Alnochromix	Alconox	2510	Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution
Ceramic glass cutter	Sutter Instruments
Chloroform	Sigma-Aldrich	650471	HPLC Plus
Curosurf	Chiesi		Lung Surfactant
Di Water			18.5 MΩ – cm
Ethanol	any		200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator	Dolan-Jenner Industries Inc.	281900100	Light source; other light sources should work as well
Flow EZ F69 mbar w/Link Module	Fluigent	LU-FEZ-0069	Microfluidic Pump
Fluigent SDK VIs	Fluigent		Required for CPM virtual Interface
Fluoroelastomer gaskets			Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3
Gas filter	Norgren	F07-100-A3TG	Put between microfluidic pump and pressure regulator
Gas regulator	Norgren	10R0400R	Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi
Glass Capilary	Sutter Instruments	B150-86-10	Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm
Glass Slide	any		75 mm x 25 mm
Glass Syringe	Hamilton	84878	25 μL glass syringe
Hydrophobizing Agent	Sigma-Aldrich	667420	1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted
Insoluble surfactant	Avanti	850355C-200mg	16:0 DPPC in chloroform
LabVIEW Software	National Instruments		2017
Longpass Filter	ThorLabs	FEL0650	650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence
Lyso-PC	Avanti	855675P	16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/  Easy-Load II pump head	Masterflex	HV-77916-20	Peristaltic Pump
MATLAB	Mathworks		R2019
Micropipette Puller P-1000	Sutter Instruments		Capillary Puller
Microtensiometer Cell and Holder			Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4
Microtensiometer Objective	Nikon		Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm
NI Vision Development Module	National Instruments		Required for CPM virtual Interface
PEEK finger tight fittings	IDEX	F-120x	10-32 Coned Ports
PEEK plug	IDEX	P-551	10-31 Coned Ports
pippette tips	Eppendorf	22492225	100 μL – 1000 μL, Autoclaved
Plastic Forceps	Thermo Scientific	6320-0010
Plastic Syringe	Fischer Scientific	14-955-459	10 mL
Plumbing parts	Fischer Scientific		3-way valves and other plumbing parts to connect tubing.
Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL	Eppendorf	3123000063	Micro pipetter
Sulfuric Acid	any		Used for acid cleaning solution
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm	Nikon		Confocal Microscope Objective
Texas Red DHPE triethylammonim salt	Thermo Fischer Scientific	1395MP	Fluorophore
Vaccum Pump	Gast	DOA-P704-AA