Isolamento, Caracterização e Aplicação Terapêutica de Vesículas Extracelulares a partir de Células-Tronco Mesenquimais Humanas Cultivadas
Summary
O presente protocolo descreve a centrifugação diferencial para isolar e caracterizar EVs representativos (exossomos e microvesículas) de CTMs humanas cultivadas. Outras aplicações desses EVs também são explicadas neste artigo.
Abstract
As vesículas extracelulares (EVs) são nanopartículas heterogêneas de membrana liberadas pela maioria dos tipos celulares, sendo cada vez mais reconhecidas como reguladoras fisiológicas da homeostase organismal e importantes indicadoras de patologias; Enquanto isso, seu imenso potencial para estabelecer terapêuticas de doenças acessíveis e controláveis está surgindo. As células-tronco mesenquimais (CTMs) podem liberar grandes quantidades de EVs em cultura, o que tem se mostrado promissor para impulsionar a regeneração tecidual eficaz e facilitar aplicações terapêuticas extensivas com boa escalabilidade e reprodutibilidade. Há uma demanda crescente por protocolos simples e eficazes para coleta e aplicação de MSC-EVs. Aqui, um protocolo detalhado é fornecido com base na centrifugação diferencial para isolar e caracterizar EVs representativos de CTMs, exossomos e microvesículas humanas cultivadas para aplicações futuras. A adaptabilidade desse método é mostrada para uma série de abordagens a jusante, como rotulagem, transplante local e injeção sistêmica. A implementação desse procedimento abordará a necessidade de coleta e aplicação simples e confiável de MSC-EVs em pesquisa translacional.
Introduction
As células-tronco são células pluripotentes indiferenciadas com capacidade de autorrenovação e potencial translacional1. As células-tronco mesenquimais (CTMs) são facilmente isoladas, cultivadas, expandidas e purificadas em laboratório, o que permanece característico das células-tronco após múltiplas passagens. Nos últimos anos, evidências crescentes têm apoiado a visão de que as CTMs atuam de forma parácrina no uso terapêutico 2,3. Especialmente a secreção de vesículas extracelulares (EVs) desempenha um papel crucial na mediação das funções biológicas das CTMs. Como nanopartículas membranosas heterogêneas liberadas da maioria dos tipos celulares, os EVs consistem em subcategorias denominadas exossomos (Exos), microvesículas (MVs) e corpos apoptóticos ainda maiores 4,5. Dentre eles, o Exos é o EV mais estudado, com tamanho de 40-150 nm, de origem endossômica e secretado ativamente em condições fisiológicas. Os MVs são formados por excreção direta da superfície da membrana plasmática celular com diâmetro de 100-1.000 nm, que se caracterizam pela alta expressão de fosfatidilserina e expressão de marcadores de superfície das células doadoras6. Os EVs contêm RNA, proteínas e outras moléculas bioativas, que têm funções semelhantes às células-mãe e desempenham um papel significativo na comunicação celular, resposta imune e reparo de danos teciduais7. As CTM-EVs têm sido amplamente investigadas como uma poderosa ferramenta terapêutica livre de células na medicina regenerativa8.
O isolamento e purificação de EVs derivados de MSC é um problema comum no campo da pesquisa e aplicação. Atualmente, a ultracentrifugação diferencial e gradiente de densidade9, o processo de ultrafiltração 10, a separação imunomagnética11, o cromatógrafo de exclusão molecular 12 e o chip microfluídico13 são métodos amplamente empregados no isolamento e purificação de EVs. Com as vantagens e desvantagens de cada abordagem, a quantidade, a pureza e a atividade dos EVs coletados não podem ser satisfeitas ao mesmo tempo14,15. No presente estudo, o protocolo de centrifugação diferencial de isolamento e caracterização de EVs de CTMs cultivadas é mostrado em detalhes, o que tem apoiado o uso terapêutico eficiente 16,17,18,19,20. A adaptabilidade desse método para uma série de abordagens a jusante, como marcação fluorescente, transplante local e injeção sistêmica, tem sido ainda mais exemplificada. A implementação desse procedimento abordará a necessidade de coleta e aplicação simples e confiável de MSC-EVs em pesquisa translacional.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os EVs estão emergindo para desempenhar um papel importante em diversas atividades biológicas, incluindo apresentação de antígenos, transporte de material genético, modificação do microambiente celular, entre outros. Além disso, sua ampla aplicação traz novas abordagens e oportunidades para o diagnóstico e tratamento de doenças21. A implementação de aplicações terapêuticas de EVs baseia-se no sucesso do isolamento e caracterização. No entanto, devido à falta de métodos padron…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32000974, 81930025 e 82170988) e da Fundação de Ciência Pós-Doutoral da China (2019M663986 e BX20190380). Somos gratos pela assistência do National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU) e do Laboratório Central de Análises e Testes do Centro de Inovação Médica Militar da Universidade Médica da Força Aérea.
Materials
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Weizhenyuan | 10053956954292 | Wound disinfection |
| Calibration solution | Particle Metrix | 110-0020 | Calibrate the NTA instrument |
| Carprofen | Sigma | 53716-49-7 | Analgesic medicine |
| Caudal vein imager | KEW Life Science | KW-XXY | Caudal vein imager |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418R | Centrifugation |
| Fatal bovine serum | Corning | 35-081-CV | Culture of UCMSCs |
| Formvar/carbon-coated square mesh | PBL Assay Science | 24916-25 | Transmission electron microscope |
| Heating pad | Zhongke Life Science | Z8G5JBMz | Post-treatment care of animals |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | Systemic injection |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | Animal anesthesia |
| Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) | Gibco | C12571500BT | Culture of UCMSCs |
| Nanoparticle tracking analyzer | Particle Metrix | ZetaView PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
| PBS (1x) | Meilunbio | MA0015 | Resuspend EVs |
| Penicillin/Streptomycin | Procell Life Science | PB180120 | Culture of UCMSCs |
| Phosphotungstic acid | Solarbio | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| Pipette | Eppendorf | 3120000224 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma-Aldrich | MINI26 | Labeling EVs |
| Skin biopsy punch | Acuderm | 69038-10-50 | Skin defects |
| Software ZetaView | Particle Metrix | Version 8.05.14 SP7 | |
| Thermostatic equipment | Grant | v-0001-0005 | Water bath |
| Transmission electron microscope | HITACHI | HT7800 | Transmission electron microscope |
| UCMSCs | Bai'ao | UKK220201 | Commercially UCMSCs |
| Ultracentrifuge | Beckman | XPN-100 | Centrifugation |
| Ultrapure filtered water purification system | Milli-Q | IQ 7000 | Preparation of ultrapure water |
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